【实验技术笔记】Western Blotting 实验操作要点及数据分析

时间：2024-01-01 15:37:02 连接器弹力接着剂

文章目录

1. 样品制备
2. SDS-PAGE 胶水制作和电泳分离
- 2.1 灌胶
- 2.2 电泳分离
3. 转膜
4. 抗体杂交
5. 图像分析
6. 常见问题分析

1. 样品制备

① 裂解：
◆ 细胞：弃培养上清，无菌 PBS 清洗 1-2 由于培养基中血清含有丰富的蛋白质，去除细胞和培养皿表面残留的培养基，加入细胞裂解液（80-100ul/60mm dish）和蛋白酶抑制剂，置摇床上摇动裂解，随时注意观察。冰上裂解最好(摇床放冰箱，培养皿放冰箱)。
◆ 组织：将组织块切割成合适的尺寸，无菌 PBS 漂洗 1-2 添加细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，均速匀浆机匀浆(低温匀浆:装有组织块的 2ml 平底 EP 在管子外面放一个装满碎冰的小烧杯)或破碎高通量组织破碎仪破碎（提前预冷裂解液，把破碎过程分成几段，缩短每一小段的破碎时间，破碎的间隙把装有组织的 EP 将管道埋在碎冰中冷却几分钟，然后进行下一小段破碎过程)。低温裂解最好。
② 去除碎片(细胞或组织完全裂解后，部分细胞碎片不能完全溶解在裂解液中，需要去除):4℃下 12000rpm 离心 10-20min，取上清。(离心后，细胞碎片沉入管底，上清中提取的蛋白质)
③ 蛋白定量： BCA 法确定蛋白质浓度后分装。
④ 蛋白变性：加 loading buffer，沸水浴煮 5min。(开水浴容易 EP 为了防止污染，管盖也可以用金属浴或 PCR 仪器使蛋白质变性。
⑤ 保存：分装变性后的蛋白质样品-20℃长期保存-80℃。也可以一裂解完就冻存在-80℃，样品收集后，一起取出，做碎片、定量、变性等后续步骤。
推荐试剂：
△ 碧云天，Western 及 IP 细胞裂解液（P0013） 裂解
△ Pierce? BCA Protein Assay Kit（23227） 测定蛋白质浓度，推荐用 96 孔板酶标仪来做，省试剂（一孔 200ul BCA 工作液)，省事省时(扫酶标仪，将数据贴到 excel 在里面，你可以计算每个蛋白质的浓度，你也可以在第一次计算时保存模板，下次直接填写模板中的数据，以获得每个浓度和每管包装体积）。
BCA 法标曲制作：(官方说明操作复杂，简化)试剂盒自带 BSA 标准浓度为 2ug/ul，设标曲梯度：准备 7 依次加入每个孔 20, 19,18,17,16,15,14 ul 0，1，2，3，4，6ul BSA 标准产品，所以标曲的蛋白点是 2、4、6、8、1012ug (可覆盖普通裂解液蛋白提取范围，超高浓度蛋白不适用)。

△ Sigma，Sample Buffer, Laemmli 2× Concentrate（S3401） 蛋白变性，蛋白质沉底好，不易飘，上样顺畅。缺点:2×的，所以只适用于蛋白质浓度高的样品。也可以使用普通的蛋白质提取物碧云天(国产精品) loading buffer。

2. SDS-PAGE 胶水制作和电泳分离

2.1 灌胶

① 洗玻璃板：玻璃板规格不同，可制备不同厚度的 PAGE 胶，注意选择合适的制胶玻璃板，制胶前使用充分清洗洗涤剂玻璃板和制胶梳，冲洗去离子水几次，将玻璃片斜靠在网篮里自然晾干，注意不要有水渍。

② 装配制胶架：玻璃板应该是配对的(一个是玻璃直角厚板，一片光滑薄板），将配对的玻璃板对齐，保持两块玻璃板底部在同一水平面上，使用固定制胶支架，然后安装在固定架上。制胶支架的松紧度(紧)制胶固定架上夹子弹簧的弹性(紧)和固定架胶条是否干净，是否具有回弹性好，灌胶时要时刻注意是否要注意漏胶，如果稍有些漏，可以在固定架上卡一 1ml 如上图所示，枪头可以人工拧紧固定架上的夹子。如果漏得厉害，没办法，只能重新组装这套。最好是同时配几块，总有一块可以用。
③ 配胶液：在 western 中用的 PAGE 胶水不连续，分两层，上层是积层胶，下层是分离胶。配的时候先配下层的分离胶，使用 500ul 无水乙醇将胶压齐(比水压好)，分离胶凝固后，倒入无水乙醇，挥发后倒入清洗去离子水残留乙醇，再加上层积层胶。 积层胶需要有一定的高度，一般孔底与分离胶之间的距离 1-2cm，距离太短，压力不好，分离胶太长，影响蛋白质分离。
④ 插梳子：梳子有不同规格，应注意不同厚度的胶水和上样体积。灌入积层胶后，立即插入梳子，动作要快，否则上样孔容易变形。插梳子时，最好用厚草纸挡住，因为没有凝固的丙烯酰胺是有毒是的，插梳子的时候不挡很容易喷脸。注意防护。聚丙烯酰胺完全聚合成凝胶要安全得多。因此，当剩余的胶水被丢弃时，你可以等待它完全凝固后再丢弃。有时候梳子拔掉了发现上样孔之间的间隔东倒西歪的，那准是插梳子时动作慢了。
⑤ 拔梳子：积层凝固后不要急着拔梳子，相反，玻璃板-胶-梳子应该作为一套整体拆下来，安装电泳槽，拔出前倒入电泳液，电泳液里含 SDS，拔梳子会更顺滑。
SDS-PAGE 胶配方：
△ 表中最后的 X% 是一般的计算公式，随 30%丙烯酰胺量调整 ddH₂O 的量。
△ 10% AP 和 TEMED 催化剂，催化丙烯酰胺聚合，TEMED 可以在 4℃保存较久；10% AP 在 4℃保存不能超过一周（建议买 10g 装的小瓶 AP 粉末，P 粉末室温会吸湿，逐渐失效，买回后直接准备分装 500ul 一管，冻存-20℃，取出一管溶解，一周内用完。

2.2 电泳分离

原理：样品在 5% 积层胶压缩成细线，这是甘氨酸盐离子的缓冲液 Gly^-和 Cl^- 的作用。在积层胶里，Cl^-跑在前面，中间是蛋白质样品，最后是 Gly^-盐离子，Gly^-和 Cl^-形成电压梯度，压缩蛋白样品；到分离胶时，Gly^-、Cl^-跑在蛋白质前，蛋白质样品脱离电压梯度限制，开始按蛋白大小以不同速度泳动，从而按蛋白大小分离开来。

积层胶浓度：5%左右，pH 6.8。

分离胶浓度：7.5-15%，pH 8.8。不同浓度的分离胶对蛋白样品的分离能力是不同的。浓度越低，分离度越好，但小蛋白容易跑出去；常用 10-12%。

电泳注意事项：
① SDS-PAGE 对离子敏感，使用去离子水配电泳液，电泳槽和配电泳液的容器也需要用去离子水润洗。
② 在上样之前，先用胰岛素针把上样孔冲一下。
③ 提前一天配好电泳液，混匀放 4℃，到用时，电泳槽稍倾斜，电泳液沿槽内壁缓缓倒入，等液体没过 PAGE 胶底边时，再把电泳槽放平，这样可以保证 PAGE 胶底边没有气泡。（电泳液中含 SDS，如果现配现用，SDS 产生的泡沫会影响电泳，如堆积在 PAGE 胶底边，导致各个泳道出现差异。）
④ 往孔里加蛋白样品慢一点，且各孔的上样体积最好保持一致，没有蛋白的那个孔也用 loading buffer 给加到同样的体积，这样跑出来的蛋白条带才能比较均一，否则会出现蛋白条带往体积小或者空的孔那边飘。别忘了上一孔预染蛋白 marker。

试剂推荐：
△ 天能（国产精品），SDS-PAGE 制胶支架、制胶固定架，梳子，玻璃板
△ 配胶的母液和电泳液如果不想自己配，推荐 迪生（产品品质稳定）的 SDS-PAGE stocking buffer 和 TGS buffer。
△ 预染的蛋白 Marker 可以用 Thermo Scientific 的 PageRuler™ Plus Prestained Protein Ladder, 10 to 250 kDa（26619）。

3. 转膜

分湿转和半干转两种。
湿转：全部泡在大量转膜液里。三明治是垂直插在转膜槽里的，从负极到正极依次是：海绵垫、滤纸、胶、PVDF 膜、滤纸、海绵垫。
半干转：少量转膜液保持三明治湿润。半干转的仪器是水平的，负极在上，正极在下，没有海绵垫，滤纸直接贴电极板，从正极到负极依次是：正极金属板、滤纸、PVDF 膜、胶、滤纸、负极金属板、塑料盖。
湿转和半干转的三明治制作及转膜液配方：
推荐：GE，PVDF 膜（A10074129）
转膜注意点：
① 建议用 PVDF 膜（结合蛋白效率高），因为 NC 膜结合蛋白的效率大概是 80-100ug/cm²，而 PVDF 膜能达到 155-300 ug/cm²。
② 转膜时，准备 2 个盘子，大盘子倒上转膜液，小盘子倒上适量的甲醇。把胶从玻璃板上剥下来，切掉积层胶的部分后就浸泡在转膜液里，与胶相同大小的滤纸也浸泡在转膜液里，浸透。切好的 PVDF 膜先别急着泡到甲醇中，而是应该让它轻轻漂在甲醇液面上 10s，在这 10s 中，甲醇就足够将 PVDF 膜激活了，而且要注意在 PVDF 膜激活后不能干掉，所以我们可以先着手做三明治，等要加上 PVDF 膜时再将膜丢进甲醇去激活，一激活就立刻给装进三明治。
③ 制作三明治时需要使用玻璃滚棒，或者拿根干净光滑的玻璃试管把膜和胶之间的气泡碾掉。
④ 湿转条件一般设置在 200mA 恒流，2.5-3h，时间比较长，需要控制发热，因为发热会影响转膜效果。最好准备一个大冰盒装满碎冰，加点水，把转膜槽埋在冰水混合物里降温；还可以在转膜槽里加一颗磁力转子，把冰盒和转膜槽整个放在磁力搅拌器上，一遍搅拌一边转；或者直接把转膜槽塞到 4℃ 冰柜里降温。
伯乐的转膜槽发热厉害，需要控制发热；法玛西亚的转膜槽，热量控制比较好，可以做到一点都不发热。
⑤ 半干转的三明治要保持湿润，但是三明治周围的金属板要保持干燥。
⑥ 半干转的条件是用恒压 20V，20min-1h。如果蛋白大的可以延长转膜时间。
⑦ 湿转能转的蛋白大小范围非常宽，普通的半干转适合转 30-120KD 大小的蛋白，有些特殊设计的半干转与湿转一样，可以转任意大小的蛋白。这需要看具体机器而定。
⑧ 转膜液也需要用去离子水配制，转膜槽和容器需要用去离子水润洗，转膜液配方需要根据蛋白大小来调整，大蛋白（>100 kD）： SDS 1g，甲醇 0 ml；小蛋白（<100kD）： SDS 0g，甲醇 200ml。
⑨ 在转膜的过程中，SDS 和甲醇的作用刚好相反。
· SDS 与蛋白质结合后，能使蛋白更容易从胶上转出来，但又能阻止蛋白与膜结合，尤其是蛋白与 NC 膜的结合。因此，大蛋白不容易转出，要额外加 SDS；小蛋白靠 PAGE 胶里的 SDS 就足够转出了。过多的 SDS 还会影响电流，增加发热，从而影响某些蛋白的抗原性。所以需要根据情况控制 SDS 的含量。
· 甲醇能破坏 SDS 与蛋白的结合，促使蛋白与膜结合，但会减小 PAGE 胶的孔径，使一些蛋白发生沉淀，从而影响实验结果，所以也得严格控制量。

4. 抗体杂交

1> 封闭：使用 5%脱脂牛奶 或 5% BSA（用 TBST 溶解）作为封闭液，封闭条件：室温 1h，或 4℃过夜。（目的蛋白转膜后，但膜上还有很多其他蛋白，因为跑胶用的是总蛋白，其他非目的蛋白也会随着转移到膜上，这样就会暴露出很多抗体结合位点，因此需要在抗体杂交前封闭膜。）
◆ BSA：一般是做蛋白磷酸化修饰检测时用，因为牛奶中含有丰富的磷酸酶，会改变蛋白磷酸化修饰的状态。
◆ 有时，封闭液配方和封闭条件也需要改变，特别是大蛋白，5%脱脂牛奶封闭一小时不够；有的蛋白可能牛奶和 BSA 都不能用，可以用明胶封闭或不封闭直接上抗体。
2> 一抗孵育：使用封闭液稀释一抗，4℃过夜，或室温或 37℃ 1-X h。
3> TBST 洗膜，室温，5min ×4 次。
4> 二抗孵育：室温 1h。
5> TBST 洗膜，室温，5min ×8-12 次。
6> ECL 显色，X 光片压片或扫膜。
TBS 配方：
1L TBS 中加入 1ml Tween 20 就是 TBST。
Tween 20：一种非离子型去污剂，有复性抗原的作用，可以提高抗体特异性识别能力；提高封闭效果，用惰性蛋白质或非离子去污剂封闭膜上的未结合位点，可以降低抗体的非特异性结合；乳化蛋白时不会破坏蛋白结构。
试剂推荐：
迪生，TBS。（一包粉末配 500mL)
GE， Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Regent（RPN2232）效果好，但贵，碧云天的性价比更高。
Thermo，SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (34080)。

5. 图像分析

使用 Gel-Pro Analyzer 或 ImageJ（推荐）
参考：
临床医生做基础科研——13.WB结果处理（推荐看这个）
【实验技术学习笔记】Western Blot条带分析｜Image J和Graphpad条带灰度分析处理过程
Western blot 经验大盘点，有这一篇就够了
用专业级的Gel-Pro测量电泳图片

6. 常见问题分析

1) 非特异条带：

抗体浓度过高：◆ 降低抗体浓度
封闭不足：
◆ 提高封闭液浓度，如从 5% 提高到 7%
◆ 增加封闭时间和/或温度
◆ 向封闭缓冲溶液中加入 0.05% 的 Tween 20
◆ 抗体稀释液采用相同的封闭液
SDS 使抗体和蛋白条带发生非特异性结合：
◆ 转膜后洗涤印迹膜。
◆ 在免疫检测过程中不要使用 SDS。
抗体质量：尝试使用不同的抗体

2) 条带弱或无条带

抗体问题，低活性或低浓度、低亲和力的一抗，错配的一抗和二抗：
◆ 提高抗体浓度
◆ 抗体可能已经丧失活性，进行斑点杂交以确定其活性和最佳浓度
◆ 测试不同一抗和/或一抗-二抗组合
抗原抗体反应不足：
◆ 增加凝胶中每个样品的总蛋白上样量
◆ 检查样品的完整性，确保蛋白未降解
抗原被封闭液封闭
◆ 尝试不同的封闭液（比如，在检测磷酸化蛋白时避免使用牛奶）
◆ 优化封闭液浓度，建议使用浓度为 3–5% 的 BSA 或脱脂奶粉
化学发光底物性能不佳
◆ 增加底物孵育时间
◆ 准备少量工作液以确定底物是否已经丧失活性。暗室内，在底物工作液中加入少量 HPR 偶联物则应该会出现蓝光。如果没有的话，必定是底物或 HRP 偶联物已丧失活性。
◆ 确保底物试剂盒中的两个瓶子之间没有发生交叉污染。两种试剂之间如果发生交叉污染，则会引起试剂活性下降。
◆ 叠氮化物是 HRP 的抑制剂，不要在二抗缓冲液中使用叠氮化物
印迹膜上抗体去除和再杂交
◆ 优化抗体去除条件
◆ 仅在必要时进行再杂交检测
◆ 避免对同一印迹膜进行多次重复再杂交
转膜不足
◆ 转膜时间过短，如果使用湿转法，则需增加转膜时间
◆ 转膜电场过弱，增加转膜电压或电流
◆ 转膜液未优化，在转膜液中加入 0.01-0.05%的 SDS
◆ 将转膜液中的甲醇浓度减少至 5% 或更少。
◆ 凝胶选择不恰当，使用更低百分比的聚丙烯酰胺凝胶
◆ 在转膜后使用丽春红染液染膜，考马斯亮蓝染液染胶，确认转移效率，并在此基础上优化转膜条件。
转过了
◆ 转膜时间过长，减少时间
◆ 转膜电场过强，降低转膜电压或电流
◆ 转膜液未优化，组装“三明治”之前，在转膜液中平衡凝胶 20 分钟以降低凝胶中 SDS 浓度，从而避免小分子量蛋白的过度转移。
◆ 将转膜液中的甲醇浓度增加至 40%
◆ 凝胶选择不恰当，使用更高百分比的丙烯酰胺凝胶
◆ 当目标蛋白分子量小于 10 KD 时使用 Tris/tricine 凝胶。使用 0.2 μm 的膜解决小蛋白转印过度的情况。
◆ 小蛋白会穿过大孔径的印迹膜，在 0.45μm 的膜后叠加 0.2 μm 的膜检测小蛋白转印过度情况

3) 信号过饱和

中空条带：
◆ 上样量过高，降低每个样品的总蛋白上样量
◆ 抗体过多，降低一抗和/或二抗浓度
◆ 化学发光底物过灵敏，更换使用灵敏度较低的化学发光底物
条带过浓以至于条带粘连在一起：
◆ 样品上样量过大，降低每个样品的总蛋白上样量
◆ 抗体过多，降低一抗和/或二抗浓度

4) 条带上有气泡：

“三明治”组装不恰当
◆ 在组装 “三明治”的时候使用更多的转膜缓冲液
◆ 组装“三明治”的时候碾掉了凝胶和膜之间所有的气泡
◆ 在抗体孵育前用丽春红染液染膜，以检查转膜质量。

5) 转膜不均匀：

印迹膜部分变干或水化不均匀
◆ 确保整张印迹膜均匀浸入转移缓冲液中并充分平衡
◆ PVDF 膜在放入缓冲液之前需要用 100% 的甲醇预先浸湿平衡
硬件问题
◆ 检查湿转装置的线路连接
◆ 确保金属平板清洁，无物理损伤，即便是金属平板发生轻微弯曲也可以极大地改变半干转印系统的电场强度
◆ 使用质量可靠的转膜仪（转膜仪的匀电场是有技术含量的，所以买转膜仪的钱不能省）

6) 背景过强：

一抗和/或二抗浓度过高：稀释一抗和/或二抗浓度
封闭不足
◆ 提高封闭液浓度，如 3–5% 的牛血清蛋白、酪蛋白、脱脂牛奶
◆ 降低封闭时间和/或温度
◆ 向封闭液中加入 0.05% 的 Tween-20
◆ 抗体稀释液采用相同的封闭液（加入 0.05%的 Tween-20)
使用了错误的封闭液，一抗和/或二抗与封闭缓冲液中的蛋白相结合：尝试其他封闭液（白蛋白、酪蛋白、脱脂牛奶等）。在使用亲和素-生物素系统时不要使用牛奶来封闭印迹膜 — 牛奶含有生物素
洗涤不足
◆ 增加洗涤次数和缓冲液用量（最少 5 × 5 分钟）
◆ 如果洗涤液中未含有 0.1%的 Tween -20，请添加
曝光时间过长：减少成像曝光时间
印迹过程中印迹膜变干
◆ 确保印迹膜保持湿润
◆ 确保印迹膜一直覆盖有足够液体以防止其变干
缓冲液重复利用导致污染：使用新制缓冲液