【实验技术笔记】基因沉默：siRNA/shRNA

参考：
实验技术笔记使用重组载体进行基因表达（pCDH 载体）
载体构造实例分析-构造 SETD3-pEGFP-N1（Snapgene 设计引物）
干货 | 寻找基因启动子，UCSC&Ensembl来助威！

1. siRNA/shRNA 的 RNAi 操作流程

1、文献中找：寻找已经验证过的（首选）
2、预设计的 siRNA 库：包含已经验证过的 siRNA 片段
3、软件设计：BLOCK-iT^TM RNAi Designer、siRNA at WHITEHEAD（blast 库长期未更新，备选)
一般设计：AA（N19）TT

https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh/product/sigma/sirna
使用方法：在搜索框中输入基因名搜索( TP53 为例）→点击左侧的 shRNA 快速查找→点击 shRNA，列表出现，设置筛选条件，查看详细信息→ 多选几个 标记已验证的干扰靶点，以消除干扰靶点脱靶效应(只有靶向目的序列的概率很低，可能与其他未知序列相结合 mRNA 上导致目的 mRNA 无变化，或结合未知 mRNA 上导致目的 mRNA 沉默）。
Sigma shRNA 结构分析 (目前只显示靶序列)

◆ polyT 的作用：酶在转录时遇到 polyT 停下，转录终止；shRNA 加工读第二个 T 后被切割成 siRNA, siRNA 带 TT 有助于组装 RISC 复合物。
◆ 可以利用 DNAMAN 查看 shRNA 的二级结构。例如：CCGGCGGCGCACAGAGGAAGAGAATCTCGAGATTCTCTTCCTCTGTGCGCCGTTTTTG，序列保存成 .seq 文件，导入 DNAMAN → Sequence → Sequence Structure → Current Sequence → OK。

BLOCK-iT^TM RNAi Designer 选择 siRNA 选项（现在没有了，可以选Stealth RNAi? siRNA、shRNA等等，使用方法相同)
输入靶基因 Accession number（如：NM_000594.4，现在无效）或靶基因CDs序列。
如果输入是 Accession number，默认选择靶序列区域 ORF（CDs 序列）。
3.选择种属。
4.其他默认点 RNAi Design。
在生成的引物中选择星号较多的，BLAST 如果超过其他基因， 15 消除碱基相同的碱基。
设计好的靶点可用于：
◆ 订购化学合成的 siRNA，直接导入细胞 RNA 干扰。正义链即软件筛选出的序列，反义链并在反向互补序列中 3’ 端加 UU 或 dTdT。
◆ 构建 shRNA 重组载体。

Sigma 直接提供的 shRNA 产品用的是 pLKO.1-puro 载体。

◆ 使用的启动子是 U6 启动子。U6 或 H1 是三型启动子，例如，启动短序列 shRNA。
◆ 构建稳转株建议用二型启动子，如 CMV、EF1 起动子，起动效率更高，可以有组织特异性，可以选择组织特异性的二型起动子。
1、按 shRNA 框架设计：
◆ 前酶切位点为 AgeⅠ的插入片段粘性末端。
◆ 后面的酶切位点是 EcoRⅠ插入片段粘性末端。
2、合成 Oligo：
3、退火：
◆ 退火体系：

◆ 退火条件： 98℃ 5min，自然冷却至室温。
4、进行后续连接、转化、阳性克隆筛选等步骤。

锐单商城拥有海量元器件数据手册、IC替代型号，打造电子元器件IC百科大全！