【教程】Western 操作步骤

实验原理：

Western,也称Western blot、Western blotting、Western印记是用抗体检测蛋白质的重要方法之一。Western Blot采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物为蛋白质，探针为抗体，标有显色二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品转移到固相载体（如硝酸纤维素薄膜）上。固相载体以非共价键的形式吸附蛋白质，并保持电泳分离的肽类型和生物活性不变。以固相载体上的蛋白质或肽为抗原，与相应的抗体发生免疫反应，然后与酶或同位素标记的第二抗体发生反应，通过底物显色或放射自显影检测电泳分离特异性基因表达的蛋白质成分。该技术也广泛应用于检测蛋白质水平的表达。

内参:

WB过程监测和目的蛋白定量标准；最重要和最不可或缺的对比是内部参考。

1.整个内参可以检测WB实验过程和系统是否正常工作，如果实验甚至不能产生阳性结果（如果内部抗体有效），则该系统存在问题；

2、起半定量标准的作用，内部参考一般选择管家基因代码表达的蛋白质，在许多组织和细胞中表达稳定，可作为检测靶蛋白表达量的标准；

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实验步骤

一、蛋白样品制备（组织中总蛋白的提取）

第一步：

法（1）敲取0.07-0.1g组织 400-500ul裂解液，放入打样管，放入打样机打样。

法(2)实验室研磨:取略大于0.1g样品放入研碗中，来回磨至粉末状，用枪头刮取收集到离心管中。

注：液氮中应进行任何操作，枪头和离心管应提前浸泡在液氮中。

第二步:将取出的样品放在冰上1-2h(中间混匀5-6次)直至完全裂解。

第三步:样品离心*取上清于新的EP管中。

(离心条件:13万rpm，4℃，30min）

注：离心机提前预冷至4℃。

二、蛋白质含量的测定

第一步:96孔板第一列1-8浓度为0、1、2、4、6、8、9、10倍 水=10或20ml，再加上5倍稀释的考马斯亮蓝染液200ml。

第二步:稀释的蛋白质样品或原液10-20依次添加到96孔板后面的几列ml5倍稀释的考马斯亮蓝染液200ml。

注：当原液浓度过高时，用裂解液稀释。

三、电泳

第一步：清洁玻璃板

第二步：配胶

(1)玻璃板对齐后，放入夹中夹紧，然后垂直卡在架子上准备灌胶。

(2)加入分离胶TEMED然后立即摇匀，然后灌胶。当胶水表面上升到玻璃板的3/4位置时。然后在胶水上加一层水，液封后凝结得更快。

注:加水液封时要慢，否则胶水会变形。

(3)当水和胶水之间有折射线时，说明胶水凝结了。将胶水倒入上层，用吸水纸吸干。加入浓缩胶TEMED然后立即摇匀，然后灌胶。将剩余空间填满浓缩胶，然后将梳子插入浓缩胶中。浓缩胶凝固后，双手握住梳子两侧，垂直向上轻轻拔出。

注：插梳子时保持梳子水平。

（4）用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。）

第三步：上样

(1)测量蛋白质含量后，计算含50mg蛋白质的溶液体积为上样量。加入适量蛋白质4:1 5*Loading Buffer于离心管，100℃水中煮5min使蛋白质变性。放在冰上3min，离心15min，13000rpm，4℃。

(2)加足够的1*电泳缓冲液开始准备上述样品。（电泳液至少应穿过内部测量的小玻璃板。）用微量进样器吸收样品，吸入气泡。将样品针插入样品孔中，慢慢添加样品。（如果有气泡，样品可能会溢出。

第四步：电泳

浓缩胶80V电压跑20分钟，多跑几分钟；分离胶180V电压跑到底部。

第五步：停止电泳

用纯水冲洗玻璃板，取胶，清洗切割浓缩胶Marker标记下切角，将胶泡在清水中。

四、转膜(跑胶时准备转膜用品，最重要的是赶气泡)

第一步：剪PVDF并提前切角，甲醇中泡2-3min。

第二步:将膜、海绵和滤纸浸泡在一起*在转膜液中，放4℃保存。

注：可回收转膜液。

第三步:打开夹子，保持黑色一面水平。在上面放一个海绵垫，用玻璃棒来回滚几次，把里面的气泡滚走。(一手擀，另一手压垫子，使其不能随意移动。)垫上2层滤纸，一手固定滤纸，另一手用玻璃棒擀去气泡。将胶盖在滤纸上，用玻璃棒轻轻擀去气泡。用镊子将膜盖在胶水上，去除气泡。覆盖膜上2层滤纸，去除气泡。最后盖上另一个海绵垫，合上夹子。整个操作在1*在转膜液中，要不断擀去气泡。膜两侧的滤纸不能相互接触，接触后会短路。

步骤4：将夹子放入转膜槽中，黑色到黑色，红色。电转移会产生热量，过热可能导致蛋白质降解，同时大量产生热量，会使凝胶膨胀，可能在胶与膜之间产生间隙，导致转膜不均匀，所以将冰箱放入转膜槽中，在冰水混合物中转膜。

注：转膜条件为电流300mA或电压70V，2h；另一个约束是电压必须控制在60-70V，调节电流。

第五步:转动后，将膜放入装水的小盒子中冲洗。倒水后，加入5%的封闭液，摇床关闭1h。

5.抗体孵化，免疫反应

第一步:回收封闭液，加入一抗，摇床30min-1h，4℃过夜，再孵化30min-1h。

第二步:一抗回收，用PBST洗5次，每次5次min。(少时多次)

第三步:加二抗，孵育2h。

第四步:二抗回收PBST洗，洗5次，每次5min。(少时多次)

第五步:用纯水冲洗5-7次，倒出纯水，加入化学发光，将膜浸泡在化学发光中2-3次min，成像。

CSL电泳个性化定制解决方案(利斧科学)

根据样置组合根据样尺寸和缓冲液容量提供不同的配置组合

Cleaver Scientific的 multiSUB水平凝胶电泳装置 考虑到科学家的设计 实验室环境。我们的 multiSUB提供水平电泳池 一个易于使用和灵活的平 满足您所有水平电泳要求的平台。该系统有广泛的槽和托盘 大小和许多梳状选择，可以 处理各种电泳实验。我们的multiSUB系列水平凝胶装置 提供目前市场上最常见的设置 DNA和RNA琼脂糖凝胶电泳 解决方案。MSMINI、 MSMIDI、MSCHOICE、 MSCHOICEST、MSMAXI、 MSCREEN、miniRAPIDE、 MSMIDI96和miniONE都提供 无与伦比的凝胶和缓冲液 多功能体积组合、凝胶尺寸和样品数量。

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multiSUB?提供各种水平电泳系列DNA和RNA琼 电泳脂糖凝胶

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?采用集成注塑制造，提供耐久性，防止 漏水特性，保证实验安全和设备持久性 耐用

?嵌入式电极设计更容易更换

?电极为99.99%的纯钳金耐腐蚀

?当用电安全时，顶盖固定在一个方向上 移开顶盖时，中断电源自动冲缓冲液

?选择多种凝胶托盘尺寸，减少过度使用 的电泳槽

?独特的电泳冷却系统

?取下按压顶盖更方便

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选择五个水平电泳池，提供一个无 凝胶和缓冲容量与伦比相结合 样品数量的凝胶尺寸和多样选择性。

每个单元都能准确匹配凝胶尺寸和样品数量要求， 还可可以选择额外的凝胶托盘尺寸。这减少了多个需求 改变凝胶的大小或应用。

所有电泳池的特点是使用可移动的紫外线透明托盘。 提供一个、两个或两个通用系统，以获得最佳效率 三个凝胶托盘选项(取决于电泳槽型号)。易于使用，防止 泄漏的即插即用凝胶浇注坝被列入标准，允许凝胶快速 同时，多亚单元用于凝胶运行。托盘上没有凹 干扰样品进样的痕迹或浇口槽。传统也可以同时使用 胶带密封。.

盖子连接器与大多数主要电源兼容，提供额外的适配器可以提供完全兼容性.

凝胶托盘

凝胶托盘是一种紫外线透明的无凹痕或浇口通道，以减少对样品的干扰

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独特的ClearSight

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ClearSight顶盖解决了冷凝堆积问题，提供一个完全透明的顶盖 观察凝胶和染料的运行过程。这是通过USB实现的电动抽风机 盖。Clearsight盖子可作为完整系统的组件或升级。

紧凑易用omniPAGE垂直电泳提供快速制胶和上样

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Cleaver Scientific提供一 全面的垂直电泳系统-包 括槽插入物和试剂-满足不足 各种凝胶大小和处理量相同 应用和技术。omniPAGE系列 包括三种尺寸的凝胶室，迷 你型10 x 10 cm，迷你型20 x 10 cm波浪型最大20 x 20 c。每个系统都有保证的防 漏密封，从而实现无故障和 快速凝胶浇铸。 这些系统是SDS-PAGE或原 生聚丙烯酰胺凝胶的理想选 择。每个凝胶罐系统包括一 个无泄漏铸造选项，可铸造 您自己的聚丙烯酰胺凝胶， 而omniPAGE mini可使用所 有主要制造商的各种商用预 制凝胶。

1. —体成型的紧凑机型-耐用，防漏的特 性提供了安全和长期使用的保障可兼容所有主流品牌的预制胶快速制胶和上样，保证了制胶的快速和可靠性通用性-可同时用于PAGE电泳和二维电泳模块，同时也可以通过使用同一个电 泳槽进行转印。

三种尺寸,Mini 10 x 10cm, Mini Wide 20 x 10cm, WAVE Maxi 20 x 20cm,具有许多 共同的特点，包括确保无漏密封，快速和 简单的制胶。内置的制胶跑胶模块，消除了传 统制胶过程中玻璃板转移的时间消耗，这一过 程会导致凝胶损坏和错位。

具有永久粘结垫片的玻璃板保证了垫片的完美 对准。

玻璃板夹芯结构简单，夹在压杆之间，密封使 用，使用方便，可使用滑动门或WAVE MAXI锁定系统。

这确保了快速安装时间，而均匀的压力和超软 密封确保制胶的防泄漏。

凝胶完成后，将凝胶运行模块简单插入电泳槽 进行实验。

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omniPAGE MINI垂直电泳组成

1. 顶盖和电源线；2. PAGE模块；3. 滑动门；4. 玻璃；5. 内缓冲液室；6. 垫片；7. 外部电泳槽；8. 制胶底座；9. 超软制胶垫；10. 梳子

操作示例

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powerPRO电泳电源 提供行业领先的规格和价值

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无论您需要用于常规水平 DNA琼脂糖凝胶电泳的电 源，还是对于技术要求很高 的技术（如大幅面垂直的 SSCP分析），还是使用 IPG条带的第一维IEF， Cleaver Scientific都可以通 过其全面的电源满足您的需 求。每个电源都有一个紧凑 的设计，这意味着实验室占 地面积小，而解释性的自我 提示菜单使设置变得容易。 此外，这些电源符合 IEC61010标准，这是世界上 最严格的电气安全标准之 一。我们的电源采用标准的 4毫米香蕉插头式连接器，与 我们自己的电泳槽和其他制 造商的电泳槽兼容。

计时不间断：999 （分钟）闹钟预设模式999（分钟）闹钟

结合卓越的规格，性能，可靠性和无与伦比的价值

每个电源都有一个2.4”的LCD显示器，显示可用的选项以及当前的运行条件。恒定的电压， 电流和电源选项，以及预编程或用户可编程程序，允许用户保存和重复他们的实验条件。5 组电源输出意味着相同数量电泳槽只需要较少的电源，当同时运行多个电泳槽时节约成本和 时间。

3AMP：完美兼容垂直电泳omniPAGE Maxi. 同时兼容转印系统omniBLOT和半干转 印.

规格 300V, 3000mA, 300W, powerPRO 3AMP是专为几乎所有的大电流电泳应用而 设计的。

powerPRO 3AMP的高电流输出能力非常适合于具有高 强度平板电极，特别是Cleaver Scientific omniBLOT maxi,VS20WAVE和半干式转印系统。电传输可以在恒 定或可编程模式下以定时运行来执行，以防止过热和缓 冲液耗尽。在恒定模式下可延长到最大999分钟的运行 时间对于以恒定小电流进行的过夜转换也是有用的。 powerPRO 3AMP共享其他powerPRO型号的内置协议和 常数参数特性。

300V：常规用于水平电泳，如multiSUB Mini, Midi and Choice，也可用于垂直电泳omniPAGE Mini.

powerPRO 300是一套多样性的平台电 源兼容不同的电泳应用在300V, 700mA和150W功率PR0300具有几乎两 倍的电流和电力市场领先的等效单位。非常适合与 Cleaver Scientific的多个SUB范围的水平电泳系统和 omniPAGEMini垂直电泳系统一起使用。powerPRO 300甚至已经从运行CleaverScience的每个电泳系统 内置了预置协议，并且允许用户创建和保存他们自己的系统的协议。

500V：常规应用于水平电泳，如multiSUB Mini, Midi and Choice.也可用于垂直电泳omniPAGE Mini、Cleaver Scientific DGGE变性梯 度电泳、垂直电泳omniPAGE Maxi。

powerPRO 500具有最大500V、 800mA和300W电压、电流和功率输 出，是一种优秀的通用电源，适合最广 泛的电泳应用。

它可以在一个恒定或可编程的设置下运行多达五个 单元，并且能够存储多达30个编程文件，每个文 件只需6个步骤。这使得powerPRO 500非常适合 需要电气参数需要细微和逐步变化中受益的应用。

例如使用Cleaver Scientific VS20-DGGE和WAVE系 统的DGGE和大格式垂直PAGE电泳。powerPRO 500甚至在运行CleaverScience的每个电泳系统时 都内置了预置协议，并且允许用户创建和保存他们 自己的程序。

chemiLiTE凝胶成像仪

通过专用的化学发 光成像仪传递高敏感度和易用性。

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Cleaver Scientific提供一系列 凝胶成像系统，从我们的入 门级microDOC Basic到一体 化的DNA和蛋白质成像 omniDOC。 omniDOC系统提供了一个简 单但复杂的成像解决方案， 同时提供了许多最高规格系 统中包含的功能，但没有额 外的价格。omniDoc适用于大 多数荧光和比色凝胶的成 像，具有高分辨率500万像素 CMOS传感器，带滑出式紫外 线透射器，可选蓝色外照射 模块和白光表。 Cleaver Scientific还为化学和 荧光成像提供一系列化学发 光记录系统。所有系统都包 括直观的采集和分析软件， 使采集和分析凝胶尽可能容易。

系统的化学发光系统可捕获化学发光信号，以检测 Western blots上的目标蛋白，其灵敏度可与膜成 像媲美或优于膜成像

• 占用空间小

紧凑的尺寸占用最小的实验空间，允许更多的实验空间

• 高量子效率(QE)相机

检测微弱的条带

• 自动化学发光捕获

完美无膜曝光

• 冷光镜头

Blots上没有恼人的背景噪音

• 固定镜头由GENEPIX软件控制

一键成像任何制造商的化学发光试剂

• GENEPIX应用驱动的图像捕捉软件

包含各种染料和成像协议的广泛数据库。选择类型的印迹和genePIX自动选择最优的照 明和过滤器，以产生完美的图像。

• GENEQUANT分析软件(无限拷贝)

在你自己的电脑上分析数据

• 优化-用于化学发光WESTERN BLOTS成像

chemiLITE配置为最高灵敏度，以确保即使是印迹上最微弱的条带也能被捕获。

• 敏感的相机

高量子效率的冷CCD相机对印迹发出的低水平光非常敏感。Peltier冷相机具有卓越的 "signal to noise”性能，减少検测的背景噪声。缩短的“相机到样品”距离进一步提高了与 化学发光样品和试剂的工作能力。与薄膜相比，化学试剂的动态范围增加了一倍以上。 这就保证了精确的量化。

genePIX采集软件可以设置为单次自动采集、系列采集 或手动采集的Westerns,生成一个或一系列定时图像

更明亮的Western blot

当弱光化学发光Westerns成像时，Binning特征可以减少曝光时 间。Binning将像素组合成更大的格式，生成一个超级像素，它 可以收集更多的光，提高灵敏度或加快图像采集时间。

完美的照片

要制作需要印刷出版的Westerns图片，只需在genePIX软件的有 效分辨率设置中选择高分辨率图像即可。genePIX软件允许对 Westerns图像进行自动叠加，它甚至可以在化学发光条 带旁生成比色分子量标记的图像。

快速图像分析

chemiLITE自带geneQUANT图像分析软件，可用于自动 计算分子量和蛋白质条带的相对定量等应用。

使用geneQUANT可以进行图像编辑，数据可保存为图 像文件，或导出到Microsoft Excel和Word。

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多重荧光和化学发光成像仪

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•化学发光成像

•荧光条带或者QDOTS, DYLIGHT, ALEXA, CY染料 和Licor IR染料染色条带

•无染色胶

•生物荧光

•植物成像

•体内成像

• ETBR或者SAFE染色的琼脂糖胶

• 2d胶

化学发光、荧光和可见染料有这么 多成像方法，你需要知道哪种成像 系统能真正捕捉到真实的结果在Cleaver Scientific,我们的专家在图像分析系统方面有多年的经验，在此期间，我们将客户的经验和反馈与我们对 成像科学的广泛理解结合在一起，提供了一个 高性能的系统，但具有简单的自动化，实验室中的任何人都可以使用.对于印迹和凝胶的结果。

准确性通过结合冷却的高分辨率相机和独特的光学成像技术， chemiPRO可以生成逼真的图像，而不仅仅是数字增强 的图像有了chemiPRO,即使在复杂的凝胶上也可以分辨出 紧密的chemi和荧光带或斑点，并知道它们是真实的

敏感性chemiPROM统是多用途的电源，用于准确的荧光成像， 多重western,琼脂糖DNA凝胶，可见蛋白凝胶，无染色凝 胶和化学

印迹该系统完全集成了计算机控制的直观的genePIX软件， 使化学反应的4.80D动态范围可以一次又一次地检测 出femtogram数量的DNA和蛋白质。

智能化学发光

当成像化学发光墨迹时，通常很难得到正确的曝光时间 通过使用genePIX,可以对chemiPRO进行设置，根据需要 快速还是高质量的图像来提供最佳曝光 由于化学的动 态范围比x射线胶片好，因此也将产生更精确的量化数据，甚至可以捕捉到可见的蛋白质标记的图像，使用genePIX,这些图像可以叠加在化学发光图像上，使分子质量的计算更容易。

北京泽平科技专业电泳设备供应18年。北京泽平一直致力为中国用户提供全球最先进的生物试剂、科学仪器、实验室消耗品、化工原料及医药中间体等技术服务。 泽平科技成立至今，已与近百家国际一线技术供应商品牌建立了长效稳定合作机制，产品技术服务囊括近20000多个品类。立足北京，放眼全球，泽平科技“以最先进技术服务用户”为己任，国内服务用户已超过20000家。欢迎留言咨询!

参考文献

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