荧光定量PCR介绍

• 什么是qPCR

qPCR也叫Real-time Quantitativ PCR，即实时荧光定量核酸扩展检测系统，就是在PCR在扩展过程中，对PCR实时监控过程，实现初始模板的定量分析。

• qPCR分类

根据Real-time qPCR 化学发光原理可分为两类： 一类是非探针类，包括如SYBR@Green I染料法等，通过染料来指示扩增产品的增加。一种是探针，包括TaqMan探针和分子信标利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩展产物的增加。

1、SYBRGreenⅠ染料法：

SYBRGreen I是一种DNA可与双链结合染料DNA小沟与双链结合DNA结合后，荧光大大增强，扩增产品可以通过这种性质进行检测。在PCR在反应系统中添加过量SYBR荧光染料，SYBRGreen掺入荧光染料DNA双链能吸收497nm激发光并发出520nm的荧光，游离的SYBRGreen染料几乎没有荧光信号。

2、TaqMan探针法

在PCR在扩展过程中添加一对引物，并在扩展过程中添加一个特殊的寡核苷酸荧光探针，分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发出的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，DNA聚合酶的5′-3’外切酶活性降解探针酶，将报告的荧光基团与淬灭的荧光基团分离，使荧光监测系统接收荧光信号，即每增加一个DNA链，形成荧光分子，实现荧光信号的积累PCR产品形成完全同步。

• qPCR定量方法

1、绝对定量

绝对定量是用己知浓度的标准品绘制标准曲线来推算未知样品的量。

将标准产品稀释到不同浓度作为模板PCR反应。以标准产品复制数的对数值为横坐标，测量CT值为纵坐标，绘制标准曲线，定量未知样品，根据未知样品CT样品的复制数可以在标准曲线中获得。

标准产品：一般选用标准质粒。标准质粒的施工步骤包括扩大目的基因片段、连接克隆载体、转换、挑选克隆、测序验证、提取质粒和质粒浓度测量。

标准梯度稀释：

标准产品的扩展曲线和标准曲线如下图所示：

根据待测样本Ct样品中的拷贝数可以通过标准曲线计算。一般标准曲线至少有5个稀释梯度，每个梯度有3个平行检测。

2、相对定量

相对定量通常是指参考内参基因，通过比较内参基因来判断特定样本中目的基因表达的增减倍数。该方法要求内参基因和目的基因具有相同的扩展效率，并尽可能接近100%。

计算相对定量：

步骤1：内参基因均匀样本差异：Ct目的基因–Ct内参基因=△Ct

步骤2:比较其他样本和对照样本:△Ct处理样本–△Ct对照样本=△△Ct

步骤3：使用公式计算：倍数变化=2-△△Ct

• 实验过程

实验流程图：

下面以SYBRGreenⅠ染料法绝对定量为例说明实现的流程：

1. DNA提取或cDNA准备（RNA提取、逆转录cDNA）。
2. 标准质粒的构建：扩增目的基因片段、连接克隆载体、转化、挑克隆、测序验证、抽质粒、质粒浓度测定。
3. DNA或cDNA模板稀释（如果样本浓度低则不需要稀释），标准品（标准质粒）稀释。
4. 体系配制：体系配制一般使用的qPCR Mix是2×浓缩液，只需要加入引物、模板及H2O即可。引物终浓度一般100-400 nM，模板根据目的基因丰度进行调整（这里一般是先做预实验）。校正染料常用ROX，根据仪器型号选择是否进行添加及添加量。体系配制一般是将Mix、引物、H2O预混后分装，最后加入模板。配制完成后，置于离心机离心。
5. 程序运行：qPCR定量一般采用两步法（即变性、退火），如果目的片段稍长，或两步法效果不好时，也可采用三步法（即变性、退火、延伸）进行定量。扩增程序结束后添加溶解曲线程序（一般仪器有默认设置）。程序设置完成后放入体系运行程序。

• 结果分析

1、扩增曲线

扩增曲线应为平滑的S型曲线，能够达到平台期。扩增曲线反应了定量过程样本管中荧光变化，起始样本目的基因越多，Ct值越小。阳性样本Ct值在15-30较好，负对照无起峰或Ct值大于35。复孔之间应重复性较好。

 

 

扩增曲线线性图谱:横坐标:扩增循环数(Cycle number ) ;纵坐标:荧光强度(De1ta Rn)。

线性基线期:指PCR反应处于起始阶段。此阶段，扩增产物很少，所产生的荧光信号很低，反应了系统背景情况。

指数增长期:指PCR达到其最大的扩 增阶段，理想条件下，每一循环后，PCR产物呈指数倍增加定量时，

线性增长期:指PCR达 到稳定的线性扩增阶段，PCR产物呈几何倍数增加。

平台期:由于原料消耗殆尽，扩增减缓，荧光信号不再随循环数增加而增加。

2、标准曲线

Ct值与起始模板拷贝数的对数存在线性关系。绝对定量通过标准曲线计算未知样本中目的基因拷贝数。标准曲线一般要求扩增效率(E)110%-90%之间，线性关系R2>0.99。

 

横坐标为log拷贝数，纵坐标为Ct值。

3、溶解曲线

我们一般通过溶解曲线判断qPCR结果的特异性，理想的溶解曲线应该是单峰、尖锐，异常的溶解曲线可能会出现双峰、杂峰等。

 

 

4、定量结果

标准品拷贝数设置完成后，仪器会根据输入的标准品拷贝数，自动计算待测样本拷贝数，根据定量时DNA/cDNA稀释倍数计算出样本中单位体积DNA拷贝数，再根据所抽提DNA的体积，抽提DNA时使用样本的质量或体积，得到单位单位质量/体积的样本中目标基因的拷贝数。所以在抽提基因组DNA时记录所使用的样本的种类和体积至关重要。

 

• 名词解释

1、基线（baseline）：在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，即称为基线。

2、阈值线( Threshhold) :荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。

3、Ct (Cycle Threshhold)值:每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为Ct值( threshold value )的10倍。Ct值也叫Cq (Quantification Cycle)

4、Rn（Normalized reporter）：是荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光发射强度的比值。

5、△Rn：△Rn是Rn扣除基线后得到的标准化结果（△Rn=Rn-基线）。

6、熔解曲线Tm（Tm Of Melting Curve）：SYBR Green染料发实验结束后需对qPCR产物加热，随着温度的升高，双链接扩增产物逐渐解链，导致荧光强度下降，到达某一温度时，会导致大量的产物解链，荧光急剧下降，将此温度称为Tm值。不同PCR产物Tm值不同，从而可对PCR的特异性进行鉴定。

7、内参基因：内参即是内部参照，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测基因的表达水平变化时常用它来做参照物。其作用是校正上样量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。一般要选择一个在处理因素作用的条件下不会发生表达改变的基因作内参。

8、标准品：用于构建标准曲线的已知浓度或拷贝数的样品。

9、拷贝数：指样本中目标基因的个数。

10、扩增曲线：根据荧光信号相对于循环数而制作的曲线。

11、扩增效率（E）：理想情况下qPCR扩增效率为100%，由1个DNA分子转变成2个DNA分子，但理想和现实总会存在差距，我们在实际实验中很难控制qPCR扩增效率稳定在100%。扩增效率偏高或偏低都会影响实验数据的准确性，控制在90%-110%之间，是时下大家公认可接受的误差范围。其中Slope是标准曲线的斜率，我们可以通过公式Eff= 10^ (–1/Slope) –1来计算扩增效率，也就是我们结果中的E。

12、StdDev Ct：Ct值的标准差，能够反应qPCR复孔的重现性，值越小代表重现性越好。