图解三代测序（Nanopore）
时间：2023-02-15 01:30:00
一、测序原理
先介绍 Nanopore 测序中的几个主角：
Reader ：在自然界中，有一种跨膜蛋白，可以嵌入细胞膜中作为离子或分子通道，具有天然的蛋白质纳米孔。人工基因工程修改后，得到的是 Nanopore 测序所需的 Reader 蛋白。
Membrane：Reader 蛋白质会嵌入高电阻率 Membrane (合成多聚物膜)膜两侧为离子溶液，两侧加不同电位，离子在孔中流动，形成电流。
Motor：在 Nanopore 在构建文库时，需要在接头上连接一种动力蛋白，用于构建文库DNA或RNA分子进入纳米孔。DNA解螺旋酶 Motor例如，它不仅能解开双螺旋，使其变成单链，还能提供驱动力。
Tether：该蛋白质用于锚定DNA或RNA链条，防止溶液中漂浮，使其进入纳米孔。
此时，解开的链条会穿过蛋白质孔，干扰膜两侧离子的稳定流动。不同的碱基对离子流有不同的影响，会产生不同的电流大小，然后形成以下电流信号图。
在使用计算机软件识别这些电流信号后，推断碱基类型，完成测序。
二、介绍测序仪
虽然 Nanopore 测序仪有很多种，但都是基于Nanopore芯片构建的平台从多个芯片阵列组成PromehION，GridION系列测序仪，小到可以连接手机Type C，电脑USB的MnION便携式测序仪系列。
在这里，最著名的是MnION2016年8月，美国宇航员凯特·鲁宾斯在国际空间站完成微重力条件DNA测序。
在测序过程中，它通常像下图一样连接，具有明显的便携性。例如，在深入疫区收集样本后，可以直接使用它进行实时分析，为防疫工作争取大量宝贵的时间和资源。
测序时，将准备好的文库或样本溶液滴入芯片孔中，开始测序。
芯片中有 2048 个 membrane wells，也就是芯片上的一个孔，每个孔都包含一个nanopore Reader。
每四个 wells 共享一个 Amplifier(信号放大器) 512 一个信号放大器，即 512 组 wells。
启动测序仪后，机器将进行自检 wells 根据效率排序。测序开始时，仪器首先使用每组 wells 中效率最高的 wells，运行 8 小时后，效率第二的替换，以此类推。
但在实际使用过程中，只有 1200 个 wells能正常工作。
造成 wells 故障原因：
- wells 中没有 Reader 当没有电信号时，蛋白质，或纳米孔不通
- 膜损坏，电信号强，无法正常测序
- 在单个 well 两个以上 Reader 蛋白质、电信号相互干扰
三、建库方法
1、1D 文库
1D文库是将DNA双链，解链为正义链和反义链，分别测序 85% 碱基判断的准确性。
目前1D文库有两种建库方案：
标准建库
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将 DNA 打断
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补齐DNA末端，末端加 A 碱基
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连接 Adapter（ 接头序列)，接头连接 Motor 蛋白
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接头中有一个序列 Tether 蛋白质结合的作用是将蛋白质结合起来 DNA 将链条吸附在膜上 DNA 锚定，不易被溶液洗走
下图是 Tether 识别和锚定接头序列
转座酶建库
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建库时使用连接测序接头的转座酶，可以使用长链 DNA 链切断
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由于酶的特性，它会出现DNA断点两端加接头序列
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然后添加到测序接头中 Motor 蛋白
2、 1 D 2 1D^2 1D2 文库
在 DNA 两侧接 1 D 2 1D^2 1D2 接头，其他步骤和 1D 文库类似。
这种文库 1 D 2 1D^2 1D2 接头，可以让第二链和第一链一起测序。
由于可以测量两条链，可以相互矫正，从而提高判断精度，可以达到 碱基判断准确率超过90%。
但由于文库质量、蛋白质活性等因素，并非所有的第一链都会在第二链之后进行测量。
五、测序影响因素
电压
以R9芯片为例，测序过程，先用 180 mV 电压，每 10 min，短时间翻转电压方向，作用是激活被堵住或卡住的 Reader 蛋白孔。但是，这个过程也会使正常测序的 DAN链倒吐回去。
随着电极使用时间的增加，电极的电压会发生漂移，因此每过两小时，要增加 5mV 电压抵消影响。
速度与产量
R9 芯片，测序速度是 250 碱基/s，一张芯片可以得到约 5 ~ 10 G的碱基序列。
六、芯片版本号
Nanopore 公司每一种新芯片就会有新 Reader蛋白，Motor，Membrane 版本号，一般命名规则如下：
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Reader：R8，R9，R10，等
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Motor：E6，E7，E8，等
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Membrane：M9，M10，等
比如，R9 指的是大肠杆菌的 CsgG 蛋白质改造的 Reader 蛋白。
总结
- Nanopore 测序是基于电学的检测，区别与 Illumina 和 PacBio 的光学
- 测序仪器便携，可用于远离实验室的地区，如疫区，农场等
- 读长较长，大约 300,000 ~ 400,000 个碱基，可用于从头组装基因组，可变剪切等
- 可以对DNA ，RNA，甚至蛋白质序列进行测序
- 碱基判读准确率较高，R10纳米孔数据质量值超过Q40（错误率0.01%），一致性（Identity）质量值达Q50。
参考：
https://www.youtube.com/watch?v=RcP85JHLmnI
https://www.youtube.com/watch?v=E9-Rm5AoZGw&t=13s
https://www.youtube.com/watch?v=sv9fFeSd3kE
https://nanoporetech.com/
