DNA测序技术发展史：一代、二代、三代测序技术简要原理及比较

DNA测序技术发展史：一代、二代、三代测序技术的简要原理及比较

爱做饭的电饭煲 2021-06-14 17:55:29 3378 收藏 13
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简要、二代、三代测序技术的简要原理
1.一代测序
1.1 Sanger测序
2.二代测序
2.1.Illumina Solexa合成测序
2.2.Roche 454焦磷酸测序
2.3.ABI SOLiD连接法测序
2.4.BGI(华大基因):纳米球测序
3.三代测序
3.1.Oxford Nanopore公司：[纳米孔测序技术]
3.2.Pacific Bioscience[单分子实时荧光测序技术：SMRT]
3.3 GenoCare：中国乃至亚洲第一台单分子荧光测序(三代测序仪)
四、一代、二代、三代测序技术比较：
4.1 第一代和第二代测序的区别：
4.2 总结一代、二代、三代测序技术的差异
4.2.1一代测序
4.2.2二代测序
4.2.3三代测序
1.一代测序
一代人需要提到一个科学家Frederick Sanger ，Sanger1918年出生于美国的生物化学家曾两次获得诺贝尔化学奖 。70年代末，他提出快速测定脱氧核糖核酸（DNA）序列技术双脱氧终止法，又称Sanger法测序技术，一代测序合成终止测序

1.1 Sanger测序
Sanger测序：双脱氧链终止法：采用DNA复制原理。Sanger测序反应系统包括目标DNA脱氧三磷酸核苷酸片段（dNTP）、双脱氧三磷酸核苷酸（ddNTP）、测序引物及DNA聚合酶等。其技术核心是ddNTP由于缺乏3‘3’-OH基团没有另一个dNTP连接形成磷酸二酯键的能力ddNTP可用来中止DNA链的延伸。此外，这些ddNTP自动化仪器或凝胶成像系统可以检测到放射性同位素或荧光标记基团。

2.二代测序
2005年，罗氏推出了第一款二代测序仪罗氏454，生命科学开始进入高通量测序时代。后续随着Illumina该系列测序平台的推出大大降低了第二代测序的价格，促进了高通量测序在生命科学各个研究领域的普及。目前，高通量测序已成为一种常规的研究方法，广泛应用于科研工作中。然而，为什么第二代测序可以实现高通量？为什么第二代测序读长这么短？为什么reads末端测序的质量会降低吗？测序读长和打断片段的长度应该如何选择？要回答这些问题，需要详细了解第二代测序的基本原理。

2.1.Illumina Solexa合成测序
采用克隆单分子阵列技术。首先将目的DNA片段打断成100-200bp，与固相基质随机连接接Bst 桥梁聚合酶延伸和甲酸胺变性PCR循环，产生大量 DNA簇，之后的反应和Sanger类似的方法次延伸产生的光信号被标准阵列光学检测系统分析和测序，终止剂和荧光标记基团在下一个循环中分解，然后继续延伸 dNTP，边合成边测序技术已经实现。

illumina测序的基本步骤
1. 文库制备

将基因组DNA打成几百个碱基(或更短)的小片段，在片段的两端加上接头(adapter)。

2. 产生DNA簇

使用专利芯片，其表面连接有一层单链引物，DNA片段变成单链后通过与芯片表面的引物碱基互补被一端“固定”在芯片上。另一端(5‘或3’)随机补充附近的另一个引物，也被固定形成桥 (bridge) “。反复30轮扩张，每个单分子扩张1000倍，成为单克隆DNA簇。DNA簇产生后，扩增子线性化，测序引物在目标区域一侧的通用序列上杂交。

3. 边合成边测序

Genome Analyzer边合成边测序系统应用（Sequencing By Synthesis）的原理。加入改造DNA聚合酶和4个荧光标记dNTP。 这些核苷酸是可逆终止子，因为羟基末端有化学切割部分，只允许每个循环与单个碱基混合。此时，用激光扫描反应板表面，读取每个模板序列第一轮反应中聚合的核苷酸类型。然后将这些基团化学切割，恢复3端粘度，继续聚合第二核苷酸。这样继续下去，直到每个模板序列完全聚合成双链。这样，统计每轮收集到的荧光信号结果，就可以得知每个模板DNA片段序列。目前的配对终端读长可达2×50 bp，长读也可以实现，但错误率会增加。读长会受到许多导致信号衰减的因素的影响，如荧光标记的不完全切割。=

4. 数据分析
碱基自动读取，数据转移到自动分析通道进行二次分析

2.2.Roche 454焦磷酸测序
避免使用边合成边测序技术Sanger宿主菌克隆法存在问题。也就是说，第一个目的DNA片段打断成300-800bp小片段，然后在5端添加磷酸基团，将3端变成平端，然后在两端添加连接子DNA样品库。之后将目的DNA将片段固定在磁珠上，将磁珠包在单个油水混合小滴中独立膨胀，从而达到一切目的DNA平行扩展片段PCR。随后将这些DNA放入PCT中共反应板进行后继测序，包括化学光反应所需的各种酶和底物。测序开始时，将T、A、G、C单分子进入顺序循环PTP 如果配对发生，焦磷酸盐分子就会被释放出来，在后续和后续ATP磷酸化酶和虫荧光素反应产生光信号，此光信号被捕获以确定碱基序列。

2.3.ABI SOLiD连接法测序
首先制备DNA文库，可使用片段文库和配对终端文库。第二阶段与焦磷酸测序相同，添加磁珠等反应元件emPCR不同的是，这种方法的磁珠只有1 μm。在连接测序中，底物是 8 碱基八聚体单链荧光探针在5′终端分别标记CY5、Teaxs Red、CY3、6-FAM荧光染料的四种颜色。3′ 端的第 1、2 位碱基类别分别对应于固定荧光染料 3、4、5 位碱基“n是随机碱基，第 6、7、8 位碱基“z特殊碱基可与任何碱基配对。一次测序中包括了五轮连接反应，可以减小测序误差

2.4.BGI(华大基因):纳米球测序
1.BGI采用了 联合探针锚定聚合技术（cPAS）和改进的DNA纳米球（DNB）核心测序技术；
2. 单链DNA它将被缠绕成一个纳米球，它可以自动附着在整齐的固定点芯片上而不堆叠（即阵列技术），然后使用组合探针锚定连接法进行测序。

整个过程包括样本准备(形成终端修复)DNA片段扩展(添加接头序列，形成单链DNA、形成环和滚环扩展DNA纳米球)，纳米球附着在芯片上并使用cPAS法测序。具体原理见文献：Science 327, 78 (2010)

3.三代测序
第三代测序技术是指单分子测序技术，DNA不需要通过测序PCR扩增，实现了每一个DNA分子单独测序。第三代测序技术又称从头测序技术，即单分子实时DNA可分为单分子荧光测序和纳米孔测序。

3.1.Oxford Nanopore公司：[纳米孔测序技术]

牛津纳米孔公司 新型纳米孔测序法（nanopore sequencing）采用电泳技术，借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔 实现测序。由于纳米孔的直径很小，只允许单个核酸聚合物通过，四种核苷酸的空间构象不同，当它们通过纳米孔时，电流变化也不同。由多种核苷酸组成DNA或RNA链条通过纳米孔时，可以通过检测纳米孔电流的强度变化来判断核苷酸的类型，从而实时测序。
3.2.Pacific Bioscience[单分子实时荧光测序技术：SMRT]

Pacific Bioscience公司(太平洋生物公司):SingleMolecule Real Time(SMRT)用荧光标记脱氧核苷酸，实时记录荧光强度的变化。当荧光基团被掺入时DNA当链条连接时，它的荧光可以同时存在DNA链上检测到。当它与DNA当链形成化学键时，其荧光基团就会被形成DNA切除聚合酶，荧光消失。这种荧光标记的脱氧核苷酸不会影响DNA荧光切除后，聚合酶活性合成DNA链和天然的DNA链条完全一样。测序过程包括两个步骤和上机两个步骤。构建文库就是长片段DNA分子与测序接头连接成茎环结构，然后添加与接头互补的测序引物和DNA聚合酶。上机测序是将构建的文库复合物载入SMRT Cell在纳米孔中，常固定在纳米孔中DNA分子，DNA聚合酶通过共价连接固定在纳米孔底部。
3.3 GenoCare：中国乃至亚洲第一台单分子荧光测序(三代测序仪)

贺建奎教授团队成功研发第三代基因测序仪GenoCare，在当今世界上，准确率最高(准确率为99.9985%)第三代测序仪率先获得政府医疗器械证书备案，初步实现产业化，并已应用于临床试验。该测序仪开发了基于全内反射先进光学的技术DNA读取分子的微弱信号DNA序列编码为亚洲乃至世界的健康和疾病提供解释和诊断信息

四、一代、二代、三代测序技术比较：
4.1 第一代和第二代测序的区别：
一代：精度高（~0.1%ER）、长(约1)kb）、通量低，价格高。
二代:精度高(1)~1.5%ER）、读长较长（150-600bp）、通量高，价格便宜。
第一代测序是合成终止测序，第二代测序开创性地引入了可逆终止终端，从而实现了边合成边测序（Sequencing by Synthesis）。二代测序在DNA通过捕捉新添加的碱基携带的特殊标记（通常是荧光分子标记）来确定复制过程DNA现有的技术平台主要包括序列Roche的454 FLX、Illumina的Miseq/Hiseq等。因为在二代测序中，单个DNA分子必须由相同的原因扩展DNA组成的基因簇，然后同步复制，增强荧光信号强度，读取DNA序列；随着读长的增长，基因簇复制的协调性降低，导致碱基测序质量下降，严格限制了第二代测序的读长(不超过500bp），因此，二代测序具有通量高、读长短等特点。第二代测序适用于扩增子测序S、18S、ITS基因组、宏基因组、DNA鸟枪法需要使用（Shotgun method）将其打断成小片段，测序后再用生物信息学方法拼接。
4.2 总结一代、二代、三代测序技术的差异
4.2.1一代测序
一代测序的最新仪器是ABI公司的3730XL。一般测序长度可达10000bp。其主要原理是使用荧光标记的核苷酸PCR边合成过程中边测序。由于四种核苷酸的荧光标记不同，因此可以了解序列信息。
一代测序精度高，精度高，但与其他平台相比，通量很低。也就是说，同时产生的数据远低于第二代和第三代。
4.2.2二代测序
二代测序技术，也被称为高通量测序技术。它解决了一代测序只能测一条序列的缺陷。随着科研的不断深入，我们开始分析一个物种或样本中的所有序列信息，这个时候一代测序一次测一条的方式就无满足我们的需求。二代测序技术就是在这样的情况下诞生的。之所以称其为高通量测序就是因为它一次能够同时测很多的序列。我们通过物理或是化学的方式将DNA随机打断成无数的小片段（250-300bp），之后通过建库（这里就不深入建库的原理了）富集了这些DNA片段。接下来将建完的库放入测序仪中测序，测序仪中有着可以让DNA片段附着的区域，每一个片段都有独立的附着区域，这样测序仪可以一次检测所有附着的DNA序列信息。最后通过生物信息学分析将小片段拼接成长片段。

二代测序特点：一次能够测大量的序列，但是片段被限制在了250-300bp，由于是通过序列的重叠区域进行拼接，所以有些序列可能被测了好多次。由于建库中利用了PCR富集序列，因此有一些量少的序列可能无法被大量扩增，造成一些信息的丢失，且PCR中有概率会引入错配碱基。所以三代测序就这样诞生了。

4.2.3三代测序
三代测序其实就是对二代测序的一个升级，简单来说就是它同样一次能测好多序列，但是测序的长度达到了10kb左右，并且不需要PCR富集序列，直接测序，这就解决了信息的丢失，以及碱基错配的问题。但目前来说三代测序依然有一定的缺陷：三代测序技术依赖DNA聚合酶的活性，且成本很高，目前的错误率在15%-40%，极大地高于二代测序技术的错误率不过好在三代的错误是完全随机发生的，可以靠覆盖度来纠错（但这要增加测序成本）。

参考文献：
1.Shendure J, Balasubramanian S, Church G M, et al. DNA sequencing at 40: past, present and future[J]. Nature, 2017.
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