HG-CoLoR用一个变阶de Bruijn graph混合校正高噪声长读数
时间：2022-11-29 00:30:00
HG-CoLoR用一个变阶de Bruijn graph混合校正高噪声长读数
1 简介
几年来，长读长测序技术不断发展，可以解决大型复杂基因组的组装问题，在此之前，仅使用短读长测序技术很难解决这些问题。 这两种长读长测序技术的主要参与者是 Pacific Biosciences 和 Oxford Nanopore。 后者随着 MinION 设备的发布可以在简单的笔记本电脑上运行，实现低成本、简单的长读取测序。
虽然长读可以达到几十个 kbps 太平洋生物科学公司的长度也达到了很高的错误率 牛津纳米孔错误率高达10-15% 30%。 由于错误率高，在下游问题中使用之前纠正长读是强制性的。 短读纠错的方法有很多，但不适合长读，主要有两个原因。 首先，这些方法不能扩展到更高的长读错误率。 其次，这些方法中的大多数都关注替换错误，这是 Illumina 数据中的主要错误类型，插入和删除长读更频繁。
1.1 相关作品
最近开发了几种长读纠错方法。 这些方法可以分为两类：要么长读长通过对齐自我校正 [PBDAG-Con ( Chin et al. , 2013 ), PBcR ( Berlin et al. , 2015 )]，或者使用混合策略和互补短读。 在这种情况下，短读可以与长读对齐 [Nanocorr ( Goodwin et al. , 2015 ), CoLoRMap ( Haghshenas et al. , 2016 )]，也可以组装成与长读对齐的组装 contig [ HALC（ 鲍和兰，2017 ）]。 De Bruijn 基于图的方法，通过遍历图的路径纠正长读取，最近开始发展，混合 [LoRDEC ( Salmela and Rivals, 2014 ), Jabba ( Miclotte et al. , 2016 )] ，以及非混合 [LoRMA ( Salmela et al. , 2017 ), Daccord (Tischler and Myers, 2017, unpublished)]。 NaS ( Madoui et al. , 2015 ) 不要用短读来纠正长读，而是用长读作为模板来招募短读，并将其组装成重叠组来纠正序列。 这种方法需要将短读与长读对齐，才能找到与长读对齐的种子。 然后将种子与所有其他短读进行比较，以招募与长读相对应的低质量区域的新短读。
1.2 贡献
我们介绍了 HG-CoLoR，这是一种新的长读混合纠错方法，它结合了短读与长读对齐(如 CoLoRMAp），以及使用 de Bruijn图，从短读(如在) LoRDEC 和 Jabba 中）构建。 但与这些方法不同，HG-CoLoR 使用可变阶 de Bruijn 图，而不是经典图。 因此，HG-CoLoR 专注于种子和扩展方法，将短读与长读对齐找到的种子用作可变阶 de Bruijn 图上的锚。 然后将种子链接在一起，以纠正短读未覆盖的长读区域。 我们的实验表明，与最先进的混合和非混合长读纠错方法相比，HG-CoLoR 它为运行时间和结果质量提供了最佳平衡，是唯一能有效扩展到真核基因组的基因组。 他们还表示，HG-CoLoR 纠错效率是指令人满意的装配效果。
变阶de Bruijn图
2.1 de Bruijn 图
de Bruijn 图是一种广泛应用于组装工具中的数据结构。 它的节点被定义为读段 k -mers，它的边表示由节点表示 k-mers 之间长度为 k-1 前缀-后缀重叠。 然而，尽管它很有用，但众所周知，de Bruijn 因为 k -mer 施工时固定尺寸。一方面，选择更大的 k 图纸可以更好地处理重复区域，但会导致覆盖不足区域的边缘丢失。 另一方面，选择较小的 k 图片的边缘将被允许在覆盖不足的区域正确检索，但在重复的区域会导致更多的分支，从而带来更多的困难。
为了克服这些问题，现代装配器通常构建多个不同的阶级 de Bruijn 图。 虽然这种方法可以提高组装集的质量，但由于需要构建和存储多张图片，它也大大增加了运行时间和内存消耗。
最近，一些方法代表权的所有方法de Bruijn图，最多为K，在单个数据结构中。 在单个数据结构中 例如，流形 de Bruijn 图 ( Lin and Pevzner, 2014 ) 将任何子串与节点相关，而不是关联 k -mers。 但由于尚未实施，这种结构主要具有理论意义。 提出了可变阶 de Bruijn 另一种实现图 Boucher 等人 （2015 年） 。 它依赖于 Bowe 等人对 de Bruijn 图片的简洁表示。 (2012) ，并支持其他允许动态更改图形顺序的操作。 然而，目前的实现只支持最多的建设 64 这太严格了，因为我们不想限制最大的顺序。
因此，我们引入了可变阶 de Bruijn 图片的新实现。 它依赖于 PgSA ( Kowalski et al. , 2015 )，关于一组阅读的各种查询的索引结构允许回答。
2.2 PgSA 概述
PgSA 它是一种允许索引一组读取的数据结构，以回答给定的字符串 f ：
读什么？ f ？
读多少次？ f ？
位置是 f 什么？
出现的次数是 f 多少？
读什么？ f 只出现一次？
读多少次？ f 只出现一次？
出现的位置是什么？ f 在 reads 只出现一次
在这些查询中， f 可以作为 DNA 符号序列给出，也可以作为一对数字给出，分别表示读取 ID 和 f 在该读取中的起始位置。
如前所述，为了回答这些查询，必须建立读取索引。 PgSA 如下构建它。 首先，将所有具有重叠的读数与这些重叠连接起来，以获得假基因组。 如果在创建假基因组后留下了一些没有发现重叠的读数，它们会在其末尾简单地连接起来。 然后，计算伪基因组的稀疏后缀数组，以及允许从伪基因组中的原始集合检索读数的辅助数组。 该辅助数组的每条记录都将原始读取集合中的读取 ID 与伪基因组中的读取偏移相关联，并且还包含标志数据，这些数据带来关于读取的补充信息，用于处理查询。 查询是通过对后缀数组进行简单的二进制搜索来处理的，并使用此补充信息。
由于在假基因组计算期间读数重叠，并且由于 PgSA 不记录任何有关其长度的信息，它只允许索引和查询一组恒定长度的读数。 但是，查询字符串的长度不是在编译时设置的，因此 PgSA 支持 f 对可变长度
2.3 变阶de Bruijn图表示
最大阶 K ，并且读取的 K -mers 用 PgSA 索引，以便能够表示所有 de Bruijn 图的节点，直到这个最大阶。 阶的 de Bruijn 图，给定节点的边 k ≤ K 是通过查询索引来检索的，使用第三个查询（即 f 什么？），后缀长度为 k - 1 的 k -mer。 查询返回一组数字对，每对代表一个 K -mer ID 和查询字符串在该 K -mer 中的出现位置。 然后处理这些对，并且仅保留那些位置分量不代表 k -1 的 K 那些（以便可以将出现向右扩展为 k -mer）。 这些扩展的出现表示 k 的前缀-后缀重叠的 k - 1 。 mer 与由当前考虑的节点表示的 k-mer，因此定义了该节点的边缘
由于通过查询索引来检索边，因此向后遍历图也很容易。 对于给定的订单 k ，不是使用节点表示的 k -mer 的后缀来查询，而是简单地使用它们的前缀来查询索引。 然后以与前向遍历相同的方式处理返回的对集合，除了仅保留其位置分量不代表 k -1 的 K 来定义边。 的 de Bruijn 图中检索任何给定节点（向前或向后）的边的 k ≤ K 中给出了允许在 补充算法 S1 。
3.1 概述
如前所述，HG-CoLoR 结合了最先进的两个想法：短读取与长读取的对齐，以及使用具有可变顺序的特殊性的 de Bruijn 图。 为此，它专注于种子和扩展方法，通过将短读取与长读取对齐来发现种子。 种子被定义为一个 5 元组（ id 、 pos 、 len 、 score 、 seq ），其中： id 是与种子关联的长读的 id ， pos 是长读上对齐的开始位置， len 是比对的长度， score 是比对的分数， seq 是在这个位置与长读比对的短读的实际共有序列。 一旦种子被检索到，它们通过扩展它们的序列连接在一起，在前面描述的可变阶 de Bruijn 图的帮助下。 该图是从短读中构建的，通过选择最大顺序 K 并用 PgSA 索引它们的 K -mers，并通过查询索引进行遍历，如前所述。 对于每次长读，遍历图以将相关种子链接在一起，这些种子用作锚点。 因此，将两个种子链接在一起所遵循的图形路径指示了长读的未覆盖区域的校正序列。 最后，一旦所有的种子都链接起来，通过进一步遍历图来扩展获得的序列的尖端，以到达原始长读的末端。 HG-CoLoR 的工作流程总结在 图 1 及其四个主要步骤如下所述。
图。1。
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HG-CoLoR 的工作流程。 首先，使用 QuorUM 纠正短读取，以尽可能多地消除测序错误。 然后， K 为该图选择 K KMC3 获得来自校正的短读数 为了进一步降低错误率，对校正的短读数应用过滤步骤，并 K 去除 出于同样的原因，只有来自校正的短读数的固体 K -mer 用 PgSA 进行索引，以表示可变阶 de Bruijn 图。 然后在 BLASR 的帮助下将先前过滤的更正短读取与长读取对齐，以找到种子。 然后独立处理每个长读取。 对于它们中的每一个，遍历该图以将相关种子链接在一起，用作锚点，以便检索长读取的未覆盖区域的校正序列。 然后，将所有种子链接在一起后获得的序列的尖端通过遍历图在两个方向上扩展，以到达初始长读的末端。 最后输出校正后的长读
是 LoRDEC）具有高度相似性，但使用源自种子的序列作为图上的锚点与 尤其 （ 使用 来自长读。 事实上，在高度错误的长读取的情况下，即使是短的、可靠 k -mers 也很有可能出错。 这种错误 k -mer 将导致使用错误的锚点，从而导致不满意的校正结果。 然而，由于短读取是准确的，它们产生的种子可以用作可靠的锚，几乎没有错误的机会。 此外，使用这些种子作为锚点还允许直接构建具有较大 k ，而无需执行多轮校正，并且在每一步都增加 k ，与 LoRMA 的方式相同。
3.2 短读校正和图构建
尽管在进行任何校正之前短读数已经准确，但它们仍然包含一小部分错误。 由于 HG-CoLoR 试图从短读取中构建高最大阶的可变阶 de Bruijn 图，因此必须从该数据中删除尽可能多的错误，以避免图中的错误路径。 为此，在 QuorUM (Marçais et al., 2015) 的帮助下纠正 了 短 读 ，在我们测试的所有短读纠错工具中，它提供了运行时间和纠正质量之间的最佳权衡。
最大阶数 K 然后为该图选择 Kokot KMC3 从校正的短读数中提取 K-mers ( et al. , 2017 )。 为了进一步降低short reads的错误率，从而避免图上的错误种子和嵌合路径，包含弱 K -mers（即 用于 出现小于某个阈值的K-mers）的short reads被过滤掉，不 以下步骤，并且仅使用实心 K -mers 来构建图形。
3.3 种子检索和合并
为了检索种子，在 BLASR 的帮助下，短读取与长读取对齐（ Chaisson 和 Tesler，2012 年 ）。 尽管它最初旨在将由插入和删除错误主导的长读取与参考基因组对齐，但在将短读取与长读取对齐时，BLASR 也设法很好地处理了此类错误。 然后独立处理每个长读取，并对相关种子应用两个分析阶段。
首先，种子是成对处理的，按照它们在长读上的对齐起始位置的升序排列。 如果给定的一对连续种子的对齐位置和对齐长度表明它们重叠了足够长的长度，则比较它们假定的重叠序列，并相应地合并两个种子。 如果假设的重叠序列不重合，或者如果比对位置和比对长度表明两个种子确实重叠，但长度不足，则仅保留具有最佳比对分数的种子。 第一个合并阶段的算法在 补充算法 S2 。
其次，一旦所有具有重叠比对位置的种子都被合并或过滤掉，这些种子再次被成对处理，按照它们在长读上的比对起始位置的升序，计算具有接近比对位置的连续种子之间的序列重叠. 与上一步一样，如果给定的种子与下一个种子完全重叠足够长的长度，则将两个种子合并。 此步骤允许考虑在对齐步骤期间未检测到的长读取中的小插入错误，这可能导致下一步中的链接困难。 第二个合并阶段的算法在 补充算法 S3 。
我们选择始终对齐所有短读取，而不是仅对齐其中的一个子集，因为这种方法可以发现更多种子。 因此，可以纠正更多的长读，以及这些长读的更大区域，并且需要探索图的较小部分。 此外，对齐步骤所花费的时间比例平均仅占整个方法运行时间的 20-40%，并且随着数据集大小的增加而趋于减少。 因此，仅对齐短读取的一个子集而不是对齐它们都不会显着减少该方法的整体运行时间。
3.4 种子链接
一旦为所有长读找到并合并了种子，HG-CoLoR 就会独立处理每个长读，并尝试通过将它们视为对并遍历图来将它们相关联的种子链接在一起。 对于给定的对，具有最左侧对齐位置的种子称为 源 ，具有最右侧对齐位置的种子称为 目标 。 为了将一对种子链接在一起，源的最右边 K -mer 和目标的最左边的 K -mer 被用作图上的锚点。 然后遍历该图，以找到两个锚点之间的路径。 当找到这样的路径时，它所指示的序列被用作对长读的未覆盖区域的校正。 搜索两个种子之间的路径首先从源到目标执行，如果找不到路径，则再次执行搜索，从目标到源。 搜索是双向进行的，因为根据遍历的起点，可能会探索到图的不同部分，从而导致不同的遍历。
HG-CoLoR 从最高阶开始遍历可变阶 de Bruijn 图。 仅当该节点没有当前订单的任何边时，或者如果其当前订单的所有边都已被探索并且不允许到达目标，则该订单在给定节点处减少。 当图的阶数减少时，来自源和来自目标的 k -mers 的大小也相应减小，因此它们仍然可以用作锚点。 还设置了最小顺序，因此 HG-CoLoR 不会遍历表示短且可能无意义的重叠的 de Bruijn 图。
当面对给定阶 数 k ，HG-CoLoR 执行贪心选择。 的节点的边 k 总是首先探索通向代表具有最高出现次数 太多节点 k ，尽管有校正和过滤步骤，但可能包含测序错误。 阶的 de Bruijn 图探索边之后 k < K ，由于没有找到较大阶的边，因此 K 在继续遍历之前， 为了避免探索太多的分支路径。
当找到两个种子之间的路径时，由于贪心选择和图的阶数仅局部降低的事实，它被认为是最优的。 因此选择它作为长读的未覆盖区域的校正。 我们自愿以这种方式选择最佳路径，而不是探索多个路径并选择与长读取对齐的最佳路径作为校正，以避免过高的运行时间。
我们还设置了一个不匹配阈值 t 当将两个种子链接在一起时， ，则源和目标可以链接在一起 K 源（或目标） K 少于 t 不匹配 K -mer （分别来源）。 尽管有校正和过滤步骤，这样的阈值允许克服仍然存在于种子上的少数错配错误。 然而，不能正确处理两个种子包含错误的情况。
此外，HG-CoLoR 可能会尝试将出现在图中未连接区域的两个种子链接在一起。 例如，如果源自另一条染色体的短读段错误地与长读段对齐，则可能会出现这种情况。 在这种情况下，将这些种子连接在一起是不可能的，因为它们之间不存在任何路径。 因此，为了避免在这种情况下对图进行昂贵的探索，设置了对分支探索的最大数量的限制。 如果达到此限制，并且没有找到链接源和目标的路径，则放弃当前的链接迭代，并且 HG-CoLoR 尝试跳过无法达到的目标。 换句话说，源保持不变，无法到达的目标被忽略，目标被重新定义为以下种子，并执行新的链接迭代。 中给出了该过程的说明 补充图 S1 。
然而，由于跳过种子可能导致大量失败的链接尝试， 即 不可能在允许的最大分支探索数内将两个种子链接在一起，因此还设置了对可以跳过的最大种子数的限制。 一旦达到此限制，由于没有任何连接尝试成功，HG-CoLoR 会在源和跳过的第一个种子之间填充长读取的未覆盖区域，并使用原始长读取的碱基。 然后再次遍历该图，以便将剩余的种子链接在一起，从第一个被跳过的种子开始，并纠正长读的剩余部分。
3.5 提示扩展
最后，很明显，种子并不总是在长读的开头和结尾对齐。 因此，为了尽可能接近其原始长度，一旦给定长读的所有种子都已链接，HG-CoLoR 继续遍历图以扩展产生的校正长读的尖端。 以与上一步相同的方式，遍历从可变阶 de Bruijn 图的最高阶开始，并且仅当给定节点没有当前阶的任何边时，该阶才在给定节点处减少。 校正的长读数的尖端因此被延伸，直到到达原始长读数的末端或分支路径。 实际上，在提示扩展的情况下，当面对分支路径时，HG-CoLoR 不知道选择哪条路径并继续扩展，也没有任何锚点，这与它试图将两个种子链接在一起时不同。 因此，多个分支的贪婪选择和探索是没有用的，出现这种情况时就干脆停止扩展。 在这种情况下，校正后的长读物的末端从原始长读物用碱基进一步延伸，直到到达原始长读物的末端。 此外，我们选择在到达原始长读的末端时始终停止扩展，即使在可以进一步遍历图的情况下，因为我们寻求执行纠错而不是组装。 进一步扩展长读取确实会使该方法更接近重叠群组装过程，而不是实际的纠错管道。
3.6 输出
填充种子未覆盖的区域，并用原始长读数的碱基扩展校正的长读数的尖端，可以保持长读数的连通性，这对于脚手架等应用非常有用。 对于校正碱基的重要性占主导地位的其他应用，还提出了经典的修剪和/或拆分输出。 实际上，在校正过程结束时，如果一个已校正长读长的碱基来自种子或可变阶 de Bruijn 图，则它可以被认为是已校正的，如果它来自原始长读长，则可以认为它是未校正的。 HG-CoLoR 以大写字母输出校正的碱基，以小写字母输出未校正的碱基。 因此，HG-CoLoR 可以输出每个更正的长读取的三个版本。 第一个版本，所有未校正的碱基都被保留，一个修剪版本，其中从长读取末端的未校正碱基被移除，以及一个拆分版本，其中所有未校正的碱基被移除，并且仅长读取的区域可以纠正的作为单独的序列输出。
4 结果与讨论
我们对 Pacific Biosciences 的模拟数据和真实的 Oxford Nanopore 数据进行了实验。 在这两种情况下，都包括了来自 A.baylyi 、 E.coli 和 S.cerevisiae ，并使用了互补的真实短 Illumina 读数。 对于真正的 Oxford Nanopore 数据，包括来自 秀丽隐杆线虫 。 由于该生物体没有质量令人满意的真正 Illumina 读数，因此使用 ART 模拟了互补的 Illumina 短读数（ Huang 等人 ，2012 年 ）。 的帮助下获得了模拟的 Pacific Biosciences 长读数，这是 Stöcker et al. , 2016 一种基于真实 Pacific Biosciences 数据开发的错误模型的最先进的模拟器。 使用以下参数来获得大约 15% 的错误率： –prob-ins 0.22、–prob-del 0.08 和 –prob-sub 0.02 。 中给出了不同数据集的所有详细信息 补充表 S1 。
我们将 HG-CoLoR 与混合纠错工具 CoLoRMap、HALC、Jabba、LoRDEC、Nanocorr 和 NaS 以及三种自纠错工具 Daccord、LoRMA 和汇编器 Canu 中使用的方法进行比较（ Koren 等人 ， 2017 年 ）。 由于运行时间长，NaS 只能在快速模式下运行。 由于 Jabba 和 Daccord 等方法只提出了拆分输出，我们还拆分了所有其他工具的输出，标记了未更正的碱基，以进行公平比较。 除非另有说明，所有实验均在配备 16 核的 32 GB RAM 机器上运行。
4.1 参数
上使用 HG-CoLoR 进行了多轮校正， 酿酒酵母 以试验参数。 因此，我们发现使用最大阶 K = 100 的可变阶 de Bruijn 图在运行时间、校正的长读取数、拆分长读取的比例、平均长度和校正碱基数之间产生了最佳折衷（参见 补充图 S2 ）。 对于两个合并阶段，允许合并两个种子的最小重叠长度设置为 99，相应于 K。 为图表选择 对于第二个合并阶段，两个连续种子之间的对齐位置的最大距离设置为 10。 该图的最小顺序设置为 k = 40，因为将其设置为较大的值会导致更大的拆分比例，因此由于局部覆盖率下降，因此长读取时间更短。 将其设置为较小的值还会导致更多的拆分和更短的长读取，因为除了更大的运行时间之外，由于探索了无意义的边缘，尤其是在重复区域中（参见 补充图S3 ）。 分支探索的最大数量设置为 1250，因为减少它也会导致更多的拆分和更短的长读取，并且增加它几乎不会产生更好的结果，但会增加运行时间（参见 补充图 S4 ）。 出于类似的原因，种子跳过的最大数量设置为 5，错配阈值设置为 3。对于短读取与长读取的对齐，BLASR 使用默认参数，但 bestn 设置为50 而不是 10，以获得更多的种子，从而纠正更多的长读。 再一次，将这个参数增加到更大的值只会影响运行时间，并没有显着改善校正结果，而减小它会导致校正的长读取数量下降。 由于我们在实验中仅使用了 50 倍的短读取覆盖率，因此将 K -mer 固体阈值设置为 1（即所有 K -mer 都被视为固体）。 最后两个参数高度依赖于输入短读取的特性。 特别是， bestn 参数应在使用高于 50× 的短 read 覆盖率时降低，而 solid 参数应在使用高于 50× 的短 read 覆盖率时增加，或者在使用非常准确的短 read 时，显示错误率较低超过 1%。 Canu 使用参数 -correct, stopOnReadQuality=false ，由于长读数的高错误率， corOutCoverage = 300 ，以便尽可能多地纠正长读数，并且 将基因 设置为每个参考的确切碱基数基因组。 此外， -nanopore-raw 用于校正真正的 Oxford Nanopore 长读数， -pacbio-raw 用于校正模拟的 Pacific Biosciences 长读数。 其他工具使用默认或推荐参数运行。 为了进行更好的比较，在运行 Jabba 之前使用 QuorUM 纠正了短读取，而不是使用作者推荐的工具 Karect ( Allam et al. , 2015 )。 所有工具都使用 16 个进程运行。
4.2 模拟数据对比
为了评估不同工具的准确性，我们首先在模拟的 Pacific Biosciences 长读数上对其进行了测试。 因此，我们能够知道在哪些位置引入了哪些错误，并精确测量了校正的准确性。 为此，我们使用了 LRCStats ( La et al. , 2017 )，这是一款专门用于测量模拟数据准确性的软件。 上的所有工具的输出统计 A.baylyi 和 E.coli 数据在 表 1 ，并在下面讨论。 因此 S. cerevisiae 数据集被自愿排除在比较之外。 这些统计数据在 补充表 S2 。
Table 1.
Statistics of the simulated Pacific Biosciences long reads after correction with the different methods, as reported by LRCStats
| Method |
Original |
CoLoRMap |
HALC |
HG-CoLoR |
Jabba |
LoRDEC |
Nanocorr |
NaS |
Canu |
Daccord |
LoRMA |
| A.baylyi |
|||||||||||
| 错误率 (%) |
17.8534 |
0.1023 |
0.0388 |
0.0310 |
0.0844 |
0.0374 |
0.5777 |
0.2961 |
8.5607 |
0.4967 |
21.7703 |
| 吞吐量 (Mbp) |
71.9 |
62.6 |
63.7 |
64.6 |
61.6 |
61.1 |
64.4 |
48.2 |
59.1 |
64.7 |
0.2 |
| 删除 (%) |
3.8909 |
0.0193 |
0.0134 |
0.0121 |
0.0629 |
0.0092 |
0.1000 |
0.0360 |
1.5961 |
0.0955 |
2.1088 |
| 插入 (%) |
13.9605 |
0.0286 |
0.0184 |
0.0178 |
0.0233 |
0.0200 |
0.4967 |
0.1916 |
6.9289 |
0.4481 |
12.8142 |
| 换人（%） |
0.7186 |
0.0700 |
0.0130 |
0.0059 |
0.0111 |
0.0137 |
0.0675 |
0.1138 |
0.7860 |
0.0290 |
8.9844 |
| 拆分读取 (%) |
不适用 |
13.85 |
3.61 |
0.01 |
2.97 |
15.19 |
0 |
0 |
0 |
1.33 |
42.18 |
| 运行 |
不适用 |
57 分钟 |
22 分钟 |
47 分钟 |
2 分钟 |
6 分钟 |
2 小时 52 分钟 |
24 小时 24 分钟 |
10 分钟 |
20 分钟 |
5分钟 |
| 大肠杆菌 |
|||||||||||
| 错误率 (%) |
17.9267 |
0.1036 |
0.0601 |
0.0596 |
0.0462 |
0.0669 |
0.3983 |
0.1935 |
8.8525 |
0.4498 |
32.9756 |
| 吞吐量 (Mbp) |
93.0 |
78.4 |
81.3 |
83.4 |
78.0 |
78.5 |
83.3 |
62.4 |
75.7 |
83.8 |
0.3 |
| 删除 (%) |
3.9091 |
0.0198 |
0.0215 |
0.0280 |
0.0389 |
0.0133 |
0.0680 |
0.0257 |
1.6533 |
0.0866 |
2.8487 |
| 插入 (%) |
14.0186 |
0.0303 |
0.0269 |
0.0347 |
0.0109 |
0.0397 |
0.3360 |
0.1385 |
7.1604 |
0.4019 |
19.3079 |
| 换人（%） |
0.7215 |
0.0693 |
0.0209 |
0.0063 |
0.0036 |
0.0240 |
0.0549 |
0.0602 |
0.7997 |
0.0306 |
13.2367 |
| 拆分读取 (%) |
不适用 |
13.13 |
9.62 |
0.03 |
4.57 |
26.12 |
0 |
0 |
0 |
0.23 |
42.58 |
| 运行 |
不适用 |
1 小时 25 分钟 |
24 分钟 |
45 分钟 |
2 分钟 |
8 分钟 |
3 小时 17 分钟 |
28 小时 48 分钟 |
12 分钟 |
27 分钟 |
5分钟 |
注意 ：突出显示每个统计数据的最佳结果。
LoRMA 的运行时很有竞争力，但它显然是所有工具中表现最差的，并且在两个数据集上显示出最小的吞吐量和最高的错误率。 实际上，使用 LoRMA 纠错后的错误率甚至高于原始错误率。 尽管长读的覆盖深度较低，但其他两个自我校正工具确实设法降低了错误率，尽管 Canu 在两个数据集上仅将错误率降低到 8% 左右，并且会从更高的覆盖率中受益。 Canu 和 Daccord 还设法产生了高通量的校正碱基，Daccord 甚至在该指标上优于所有其他方法。 除 NaS 外，所有混合方法的吞吐量都相当。 这种较低的吞吐量并不意味着 NaS 校正的碱基比其他工具少，而是来自这样一个事实，即 LRCStats 报告的吞吐量是根据原始读数和校正读数之间的比对计算得出的。 由于 NaS 将短读取组装成重叠群并将它们用作校正的长读取，这表明产生的长读取的不可忽略量不会与它们最初来自的长读取重新对齐，而是在基因组的另一个区域对齐. 所有混合方法也令人满意地降低了错误率，始终低于 1%，最高来自 A.baylyi 数据集用 Nanocorr 校正，只有 0.57%。 当更具体地查看不同类型的错误时，似乎 Jabba 在删除方面遇到了最大的困难，在 CoLoRMap 方面面临着替换，在所有其他工具方面都面临着插入方面的困难，这些都是分析数据集上最常见的错误。 还值得注意的是，CoLoRMap、HALC 和 LoRDEC 确实拆分了重要比例的长读，这意味着这些长读的大区域没有被纠正，因此，参考基因组的大区域有很高的机会被发现. 在查看运行时，Jabba 总是表现最好，而 Nanocorr 尤其是 NaS 显示出令人望而却步的运行时。 HG-CoLoR 没有达到这样的运行时间，尽管它比除 CoLoRMap 之外的所有其他工具都慢。 HG-CoLoR 的错误率也低于所有其他工具，除了 大肠杆菌 数据集上的 Jabba。 在这两个数据集上，HG-CoLoR 的吞吐量也高于除 Daccord 之外的所有其他工具。 最后，它产生的拆分长读取的比例小于所有其他可以拆分读取的工具。 因此，HG-CoLoR 在这两个模拟数据集上提供了运行时间和结果质量之间的最佳平衡。
4.3 真实数据对比
根据模拟数据的结果，我们选择将 LoRMA 从与真实数据的比较中排除，因为它的总体结果并不令人满意。 我们还选择排除 CoLoRMap、HALC 和 LoRDEC，因为它们产生的拆分长读取占重要比例。 最后，由于它在真实数据集上的所有混合工具中表现最差，我们也排除了 Nanocorr。 中给出并评论了从该比较中排除的工具的结果 补充表 S3 和 S4 。
我们用两种不同的方法评估不同工具的准确性。 首先，我们分析长读取与参考基因组的对齐情况，其次，我们研究可以从校正的长读取中生成的组装质量。
4.3.1 基于对齐的比较
长读在校正之前与 Last ( Kielbasa et al. , 2011 ) 对齐，因为它更好地处理原始长读。 然后运行不同的校正工具，将获得的校正长读数与 BWA mem ( Li and Durbin, 2010 ) 对齐，因为它们具有很高的准确性。 结果在 表2 并在下面讨论。
表 2。
使用不同方法校正前后真实牛津纳米孔长读数的统计数据
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| 方法 |
原来的 |
HG-彩色 |
贾巴 |
在里面 |
唱歌 |
好的 |
| A.baylyi |
||||||
| 读取次数 |
89 011 |
25 278 |
16 618 |
24 063 |
8122 |
19 623 |
| 拆分读取 (%) |
不适用 |
1.01 |
4.90 |
0 |
5.47 |
53.02 |
| 平均长度 |
4284 |
11 157 |
10 260 |
8840 |
9345 |
3244 |
| 碱基数 (Mbp) |
381 |
285 |
179 |
213 |
81 |
175 |
| 平均同一性 (%) |
70.09 |
99.75 |
99.40 |
99.82 |
97.79 |
91.92 |
| 基因组覆盖率 (%) |
100 |
100 |
99.82 |
100 |
99.79 |
100 |
| 运行 |
不适用 |
1 小时 56 分钟 |
2 分钟 |
94 小时 18 分钟 |
32 分钟 |
45 分钟 |
| 大肠杆菌 |
||||||
| 读取次数 |
22 270 |
21 970 |
21 005 |
21 818 |
17 154 |
17 478 |
| 拆分读取 (%) |
不适用 |
0.07 |
4.98 |
0 |
0.38 |
34.40 |
| 平均长度 |
5999 |
6093 |
5797 |
7926 |
7080 |
4495 |
| 碱基数 (Mbp) |
134 |
134 |
128 |
173 |
122 |
119 |
| 平均同一性 (%) |
79.46 |
99.84 |
99.81 |
99.86 |
96.23 |
98.51 |
| 基因组覆盖率 (%) |
100 |
100 |
99.43 |
100 |
99.99 |
99.99 |
| 运行 |
不适用 |
1 小时 05 分钟 |
3 分钟 |
72 小时 02 分钟 |
36 分钟 |
30分钟 |
| 酿酒酵母 |
||||||
| 读取次数 |
205 923 |
72 228 |
33 484 |
71 793 |
— |
— |
| 拆分读取 (%) |
不适用 |
5.13 |
11.47 |
0 |
— |
— |
| 平均长度 |
5698 |
6724 |
6455 |
5938 |
— |
— |
| 碱基数 (Mbp) |
1173 |
512 |
243 |
426 |
— |
— |
| 平均同一性 (%) |
55.49 |
99.10 |
99.54 |
99.59 |
— |
— |
| 基因组覆盖率 (%) |
99.90 |
99.40 |
93.32 |
98.70 |
— |
— |
| 运行 |
不适用 |
8 小时 36 分钟 |
12 分钟 |
>16 天 |
— |
— |