• 参考：载体构造实例分析-构造 SETD3-pEGFP-N1（Snapgene 设计引物）

（1）寻找 CDS 序列

• 以 TNF 为例，将 CDS 序列复制到 DNAMAN，保存为 .seq 文件。
  

(2)分析酶切位点：找出载体多克隆位点 MCS 是的，酶切位点插入基因中没有。

• DNAMAN 中载入 TNF 序列文件：Sequence → Load Sequence → From Sequence File → 选择保存在前面的 TNF.seq 序列文件。
  
• 寻找 TNF 基因中的酶切位点：Restriction → Restriction Analysis → 勾选 Show summary 和 Show sites on sequence → 下一步→Select All → 完成。
  
  
• 注意输出结果 Non Cut Enzymes （不会切 TNF 基因酶切位点)，找出载体(以pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP以载体为例，多克隆位点 MCS 是的，酶切位点插入基因中没有。
  
  
• 找出切割效率高的酶切位点：达到切割效率 90%以上是最好的；排除同尾酶，即切割后性末端不能相同(如 XbaⅠ和 NheⅠ是同尾酶)。常用酶切位点表(含保护碱基)
  
• 找出在相同 buffer 和温度下工作的酶切位点：
  ① 利用 NEB 官网的 Double Digest Finder 工具，输入选取的在载体上不相邻 双酶切位点(如XbalⅠ、BamHⅠ），查看酶的 Buffer、反应温度 及相应的 酶切效率。
  如图，BamHⅠ标记了 星号，表示酶在对应 buffer 有星号活性(非特异性酶切活性)，酶会乱切，把 DNA 切断，所以要避免有星号活性的酶，此处 BamHⅠ不可选。
  

② 但在输入 BamHⅠ时提示还有 BamHⅠ-HF， HF 代表是转化后的切割效率较高，选择 BamHⅠ-HF 结果如下图所示，XbalⅠ和BamHⅠ-HF都能在 37℃ rCutSmart Buffer 中达到 酶切效率100%，可选。

(3)添加保护碱基和 Kozak 序列

• 在酶切位点外侧添加保护碱基，可为外切酶提供支撑点，提高酶切效率。XbalⅠ和BamHⅠ-HF保护碱基分别是 GC 和 CG
• Kozak 序列（GCCACC AUG G）是真核生物 5’帽子结构后面的核酸序列可以与翻译的起始因素相结合。介导包含 5’帽结构 mRNA 翻译的开始。对应原核生物 SD 序列。核糖体可以识别这个序列，并作为翻译的起点。
• 注意：下游引物是规则框架设计 反向互补序列。
  

(4)验证引物是否合适 PCR： (不合适也没办法，载体引物的局限性)，只看部分与目的基因互补（目的基因 CDS 序列），引物 Tm 值只计算与目的基因完全互补的部分。

• 参考：载体构造实例分析-构造 SETD3-pEGFP-N1（Snapgene 设计引物）

• 参考：【实验技术笔记】RNA 抽提 反转录 PCR PCR 引物设计 RT-qPCR
• 与做 RT-PCR 只是酶不同。
• 推荐：高保真酶 TOYOBO KOD-Plus-Neo（KOD-401） 便宜的大碗，性能好。
  Agilent PfuUltra II Fusion HS DNA Polymeras（600670） 稍微贵一点，性能强。
• 反应液配制：配置后，可额外添加 0.5 μl ExTaq，加 ExTaq 的 PCR 产品尾带突出 A 碱基，做起来方便 TA 克隆。
  
• PCR 程序：克隆 PCR 建议用 Touchdown PCR 程序设置。在普通 PCR 前加 10 个循环的 Touchdown 程序，一般从 68℃降到 58℃（如果还 P 不出来，可以从 72℃开始降到 58 或 55℃）。
  

• 酶切体系：分 2 管，一管切载体，一管切载体 PCR 产品。各种内切酶 1ul，10×buffer 2ul，37 ℃ 酶切 2h 后跑胶回收。
• 推荐： NEB的酶，选择多，高效的酶多。
  

• 1.1%琼脂糖凝胶电泳后分别切胶回收载体片段和目的基因片段，0.5cm 胶块 300μl 熔胶液，55-60℃ 加热熔胶。
• 2、上柱，离心 5000g×5min 过柱。
• 3、700ul wash buffer，最大速离心 1min 洗柱 2 次，最大速离心 2min。
• 4、50ul ddH₂O(最好加热到 5060℃），最大速离心 2min 洗脱（建议洗脱 2 次，把第一次洗脱的液体吸到柱子里再离心一次，提高产率），Nanodrop 测浓度。
• 推荐：胶回收试剂盒，OMEGA，Gel Extraction Kit（D2500-01） 不推荐国产的如天根、生工（效率较差）。
  

• 用 T4 DNA Ligase 把 PCR 产物酶切回收片段 (insert) 和载体酶切回收片段 (vector) 连接在一起，16℃连接 4h 或过夜。（连接温度以 16℃为佳，但是 16℃的连接温度没有金属浴不好办，还是 4℃
  过夜（12-16h）比较方便，其实室温下几个小时也是可以的。）

• 连接体系：
  
  ◆ 载体酶切回收片段加到 100ng 以上，加少了连接产物可能比较少；
  ◆ 连接体系按连接酶说明书配制（通常 10μl 连接体系中 T4 DNA 连接酶加 1μl，10×buffer 加 1μl）
  ◆ 酶切载体片段与目的片段的摩尔比例，建议以 1:5-1:10 之间比较合适，可使用 克隆构建摩尔比计算工具 进行计算每 μl 酶切载体片段需要加多少 μl 目的片段，将 ABCD 4 个位置的示例数据替换成你的实验数据，即可自动计算出不同比例下每 μl 酶切载体片段需要加多少 μl 目的片段。（可以 vector 加 100ng，然后剩下的体系全部加 insert，不加水？）
  

• 推荐：NEB，T4 DNALigase（M0202）

• 1、挑阳性克隆摇菌：用无菌枪头挑阳性克隆到含 1‰ 抗生素的 LB 培养基（大肠杆菌）中，37℃ 200rpm 摇床上培养过夜（10-12h，不要超过 16h，时间过长，菌长老了提取效果就不好。当然如果给的培养基量大，可以适当延长摇菌时间。）；

• 2、菌落鉴定：
  ◆ 方法一：酶切鉴定：摇好的菌液抽提质粒（小抽），做酶切、电泳，看目的片段有没有插入载体中（先摇菌，再提质粒，酶切完跑胶鉴定，好麻烦。而且很费钱呀，限制性内切酶、质粒小提的盒子，都不便宜。因此不建议在单纯需要菌落鉴定时使用。）；
  ◆ 方法二：直接做菌液 PCR，吸 1ul 摇好的菌液，PCR 的酶可以用做 RT-PCR 的 2×Mix，PCR 引物直接用做克隆构建用的 PCR 引物，电泳看是否有目的条带。
  △ 菌液 PCR 就是利用菌体高温裂解释放出的 DNA 为模板进行的 PCR 反应，菌液 PCR 需要先挑菌落于 1ml 含抗生素 LB 中，摇菌 1-2h，然后取 0.5μl 加入到 PCR 体系中，然后上机。
  △ 第一天下午质粒转化后铺板，第二天早上挑菌落，进行菌液 PCR 检测，电泳完看到结果基本上快中午了。如果此时直接把 PCR 阳性的菌落/菌液拿去摇菌，时间安排就很难受，摇 10h 是晚上，摇 16h 是半夜。所以可以将菌液 PCR 这前摇了 2 小时的菌液放到 4℃，待晚上离开实验室前，再加 LB 培养基摇菌，第二天早上来提质粒。
  △ 菌液 PCR 体系：
  
  △ PCR 程序：
  95℃ 15min，时间短的话，可能解链不完全
  95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 60s，25 个循环
  72℃ 7min，暂存 4℃或电泳

• 3、测序：有条件的实验室可以自己测，没有条件的话，就送公司检测，费用不贵，每个反应十几元，每个反应能测约 700bp。这也是前面设计引物时控制 PCR 产物长度在 200-500 的重要原因之一。
  质粒构建完成，送测序，推荐直接送菌液测序，公司提取后检测。自己提取质粒然后送测序，有可能会测不出来。若要自己提，推荐 OMEGA 质粒小提盒，无内毒素为佳。测序结果与目标序列对比，正确则为构建成功。

• 4、测序后抽提重组质粒（大抽），按试剂盒说明书提取，用于后续步骤。

• 推荐：OMEGA，E.Z.N.A. Endo-Free Plasmid Mini Kit（D6948-01）
  

脂质体转染

• 参考：什么是脂质体？脂质体转染的原理和步骤？
• 1、提前铺细胞，使转染时密度达到 80%左右。密度太低细胞容易死，太高影响转染效率；
• 2、使用 OPTI-MEM 分别稀释 lipofectmine 2000（脂质体载体，转染试剂） 和 重组质粒（没有内毒素的）后轻轻混匀（脂质体不耐吹打），室温孵育 5min 后逐滴加入提前铺好的待转染细胞中。
• 推荐：Lifetechnology，Lipofectamine 2000 Reagent（11668） 质粒比较大或细胞难转染，可以用 Lipofectamine 3000。
  

慢病毒包装（以 PLKO.1-PURO 体系为例）

● (1) 材料：psPAX2（无内毒素），pMD2.G（无内毒素），测序正确的带有插入片段的 PLKO.1-PURO（无内毒素），HEK-293T cells，OPTI-MEM® serum-free media，转染试剂 lipofectmin 2000。

● (2) 步骤（以 60mm 圆皿为例）：

• a) 转染前一天，在 60mm 圆皿中接种 HEK-293T 细胞，37℃，5% CO₂ 培养过夜。注意接种时调整接种密度，使转染时细胞融合约 50-80%。如果养细胞时加了双抗，此时要去掉抗生素。
• b) 转染当天：（尽量下午或晚上转染）
  △ 预混质粒，三个质粒的比例是可以优化的。
  △ 预混 LIPO2000：LIPO2000 20μl 加 OPTI-MEM 至 500μl。
  △ 两者混合，室温静置 5min，将混合液缓慢分散加入培养皿中，37℃，5% CO₂ 继续培养。
  
• c) 转染次日：转染 8-12h 后更换完全培养基，可恢复双抗，37℃，5% CO₂ 培养 24h。
• d) 转染第二日：收集培养基上清，即可得到慢病毒颗粒，1200rpm 离心 5min，去除混杂的 293T 细胞，存-80℃。
• e) 转染第三日：再次收集培养基上清，也可得到慢病毒颗粒，1200rpm 离心 5min，去除混杂的 293T 细胞，存-80℃。
• f) 病毒滴度测定及 MOI 测定：采用有限稀释法，建议参考吉凯、吉玛、汉恒公司慢病毒使用手册。

• QPCR 或 WB 检测
• 详见：
  【实验技术笔记】RNA 抽提 + 反转录 PCR + PCR 引物设计 + RT-qPCR
  【实验技术笔记】Western Blotting 实验操作要点及数据分析