综述：微生物群落的生物技术潜力及应用
时间：2022-08-22 09:30:00
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探索微生物领域的奥秘
编译：赵博
英文标题：
Biotechnological potential and applications of microbial consortia
中文标题：
微生物群落的生物技术潜力及应用
第一作者：
Xiujuan Qian1
通讯作者：
Min Jiang1,2，Fengxue Xin1,2
期刊：
Biotechnology Advances
作者单位：
1 State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering, College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering, Nanjing Tech University, Nanjing, China
2 Jiangsu National Synergetic Innovation Center for Advanced Materials (SICAM), Nanjing Tech University, Nanjing, ChinaAHLs
摘要
微生物群落的最新研究进展为扩大代谢工程的范围提供了有效的途径。系统生物学使我们能够充分了解细胞的各种生理过程及其相互作用，从而为合成微生物群落的优化设计提供见解。然而，对合成微生物群落的研究仍处于起步阶段，在构建细胞间通信和稳定可控的微生物群落系统方面面临着许多未知和挑战。本文全面总结了定义的微生物群落在人类健康管理和药物开发、有价值化合物合成、木纤维素材料联合生物加工和环境生物修复等领域的最新应用。同时，重点介绍合成微生物群落进一步发展面临的高效、稳定、可控的突出挑战和未来发展方向。
01
引言
传统的无氧培养代谢工程为生产大宗化学品和有价值的产品提供了良好的机会。然而，外源性基因固有的排他性、缺乏新酶、沉默途径和对严格培养条件的要求总是影响生物产品的效率和生产力。因此，商业微生物生产化学品和燃料的成功案例数量不能满足预期，这留下了一个问题：传统的代谢策略，即超级细胞工厂的建设是否足以支持可持续的生物精炼。
然而，奶酪和酱油等传统食品发酵工艺通常是由多个菌株或物种组成的混合培养物。此外，通过传统的培养技术，环境中99%以上的微生物无法成功培养。研究人员将合成生物学从传统的单细胞设计扩展到混合培养系统的构建。正如预期的那样，近年来，越来越多关于探索微生物群落潜力、不同微生物合成分布、细胞间通信机制和微生物群落系统计模型建立的研究被广泛报道（图）.1）。
图.1微生物群落发展中一些关键里程碑的时间表
在系统复杂性和功能性方面，人工微生物群落的建设开辟了合成生物学的新视野。首先，这些复杂的菌群为菌株创造了新的微环境，可能会激活正常培养条件下未表达的沉默代谢途径，从而发现新的化学物质，给微生物菌群特别是新药开发带来了广阔的应用前景。此外，人体内微生物菌群的行为是影响人类健康的重要因素，因为人类正在与寄生在我们体内的数万亿微生物一起进化。这些微生物创造了一个复杂的生态系统，具有人类栖息地的特异性和适应性，以适应宿主不断变化的生理状态。其次，微生物群落采用分工的方法，种群相互分担负荷，从而提高效率，完成比单株更复杂的行为。在菌群中，通过改变构成菌株的比例，可能更容易优化模块化通道。在培养单一菌株时，需要对启动子、核糖体结合点、终止子和载体进行一系列分子工程操作。第三，这些人工微生物群由多种功能微生物组成。与单一菌株相比，它们对环境条件的挑战更具活力和代谢能力。
本文综述了人工微生物群落在人类健康管理、有价值化合物合成、木纤维素生物精炼联合生物加工和环境生物修复领域的应用，强调了合成微生物群落的建设策略，旨在发展微生物群落在更多领域的应用潜力。同时，本文进一步指出了人工微生物群落发展面临的重大挑战和未来的发展方向。
02
微生物群落在人类健康管理中的应用趋势和潜力
亚历山大于1929年·由青霉菌和葡萄球菌组成的微生物群落意外发现了青霉素，这被认为是上个世纪最具影响力的科学突破之一。此后，随着生物技术的发展，越来越多的新型化学物质被发现。表1总结了过去10年使用微生物群落合成的新化学物质。可以看出，它们大多表现出抗菌特性，只能在微生物群落系统中找到。由于抗生素耐药菌株数量的增加，新抗生素的研发需求比以往任何时候都更加迫切。微生物群落的独特性明显突出了其抗生素化学合成的潜力。
表1对混合培养中发现的新二次代谢物的最新研究
越来越多的微生物基因组序列表明，在标准实验室条件下，许多人负责合成二次代谢产物（SMs）在支霉菌中，沉默的糖肽基因簇可能是沉默的。有证据表明，一些沉默基因簇的激活需要其他微生物的实体。为了发现微生物群落背后未被揭示的相互作用机制，从物理接触、化学通信和基因突变的角度进行了一系列研究.2）。
在化学通信方面，微生物可以产生一些信号化合物，如N-酰基高丝氨酸内酯（AHLs）和小肽，群体感应（QS）作为转录调节因子和表观遗传修饰因子。AHLs革兰氏阴性菌用于种植QS一旦在环境中AHL浓度达到阈值水平，就会激活LuxR家庭转录调节蛋白质。LuxR/AHLs包括AHLs合成所需的基因(图).2a）。这种QS该机制已成功应用于大肠杆菌，建立了细胞间通信的时空调节，通过调节细胞生长和死亡来控制微生物群中的种群数量，以减少不同物种之间的基质竞争。在革兰氏阳性菌群中，它被称为自诱导肽(AIPs)主要用作小肽QS分子。与AHLs不同的是，这些多肽在序列和结构上各不相同，它们通过专用的转运蛋白从细胞主动运输至胞外。AIPs调控的QS该系统通常采用双组分遗传调节机制-膜结合AIP受体-组氨酸激酶（HK）和DNA结合反应调节因子(图).2b）。在细胞外环境中AIP它将被受体达到临界浓度HK磷酸化并导入细胞。磷酸化的AIP将与目标DNA结合，调整其转录。除同一属中存在化学通信外，QS原核生物-真核生物的相互作用似乎也受到分子的影响。例如，在真菌/细菌的互利共生中生中发现苷色酸衍生物，这意味着苷色酸在微生物通信中的作用。基于上述发现，将通过QS分子的产生与相应的受体和启动子相关，更容易构建通信系统，从而设计出可控的微生物群落。
除了图.2a和b中所示的自由扩散的QS除分子外，一些信号分子的输送还需要特殊的结构辅助。例如，长链AHLs疏水信号分子通过膜囊泡通过(MVs)在细胞间运输(图.2c）。在某些情况下，微生物群中的细胞需要亲密的物理接触来引起特定的交流。典型的例子是巢曲霉和放线菌的相互作用。在这种情况下，典型的多酮化合物只有在群落中的两个细胞物理接触后才能被生物合成.2d）。
进一步的基因水平分析表明，微生物群落通过基因丢失、组蛋白修饰和水平基因转移引起了一系列的基因表达变化（图）.2e）。例如，棒状链霉菌和金黄色葡萄球菌N315共培养，导致棒状链霉菌1.8Mbp该质粒占基因组含量的21%。因此，棒状链霉菌在这个微生物群落系统中获得了结构性产生全霉素的能力。据推测，这是因为棒状链霉菌基因片段的丢失可能会减轻复制和基因表达过程中的代谢负担，因此沉默的全霉素合成方法被特异性激活。它是抗生素吡咯啉的成员，对金黄色葡萄球菌具有大的细胞毒性。细菌也可以通过主要组蛋白乙酰转移酶复合物Saga/Ada诱导组蛋白修饰改变真菌基因表达。组蛋白乙酰化通常与转录激活有关，从而调节基因表达。此外，基因组分析显示红球菌307CO微生物群落系统中含有来自链霉菌的大型DNA片段导致红链霉素A和B产生新同分异构体抗生素。事实上，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌之间的水平基因转移是常见的，可以定义为捕食，导致捕食者将猎物转移DNA并入其中。
微生物群落内部的相互交流是一个非常复杂的过程。目前，探索这种相互作用机制最有效的方法是通过表定的代谢相互作用或引入报告菌株，然后建立具有代表性的微生物群落模型库。因此，应开发宏基因组学、系统生物成像质谱仪、微流控技术和流细胞仪、细胞分离打印、高通量培养等更先进的感知和分析技术。
微生物群落除了发现抗生素化学物质外，在临床研究中也有着光明的应用前景。定居在人体内的微生物，包括粘膜和皮肤环境，至少和我们的体细胞一样丰富，肯定比人类基因组含有更多的基因。除遗传和环境因素外，人体内微生物菌群的行为也是影响人体健康的重要因素。例如，肠道微生物菌群现在正在成为个性化医疗的重要参与者，因为它能分解人体无法消化的多糖，对肠道免疫系统的发育和动态平衡至关重要，并能抵抗病原体。加强对微生物群落影响的理解，更好地阐述这类群落的确切运行机制，也成为人类微生物群体的优先研究内容。
图.2.微生物群落的相互作用机制模型。（a）革兰氏阴性菌群的群体感应。典型的革兰氏阴性菌群LuxIR环路中，LuxI型蛋白催化成N-酰基高丝氨酸内酯（AHLs）自诱导物（五边形）。一旦AHLs在环境中浓度达到阈值水平，就会激活LuxR家族的转录调节蛋白。LuxR/AHL复合物可以激活多个靶基因的表达，包括AHLs合成所需的基因。（b）革兰氏阳性菌群的群体感应。自诱导肽（AIPs）从细胞主动输出并结合到细胞外受体-HK的传感器区域。当AIP在环境中达到临界浓度时，受体HK将其磷酸化并导入细胞，磷酸化的AIP将与目标DNA结合，调控其转录。（c）使用膜囊泡(MVs)的信号分子传输模型。革兰氏阴性菌从细胞表面将产生的细胞掐掉，形成一个球形容器。MVs与受体细胞融合，传递疏水信号分子，随后激活靶基因的转录。（d）物理接触模式。典型的例子是构巢曲霉与放线菌密切接触，导致Saga/Ada复合物催化组蛋白H3乙酰化的增加。（e）微生物群落的基因水平变化。混合培养可引起基因表达的一系列变化，表现为基因丢失、组蛋白修饰和水平基因转移。
03
利用菌落中不同菌种间代谢途径的分布合成有价值的化合物
合成生物学和代谢工程在合成高价值产品的模型微生物（如大肠杆菌和酿酒酵母）的构建和代谢途径优化方面取得了很大的进展。通常，这些产物只能通过较长或复杂的代谢途径合成。例如，由葡萄糖合成紫杉醇需要35~51个步骤。通过对大肠杆菌的代谢途径进行修饰，得到了最高的紫杉醇前体物——紫衫烯滴度，为1.02g/L。然而，这一过程与工业生产仍有很大的差距。在另一项研究中，在酿酒酵母中构建了一条包含10个基因的生物合成途径，用于从(R,S)-全去甲劳丹碱合成二水血根碱和血根碱。这种复杂的生物合成途径只能使1.5%的反应物转化为二水血根碱。通常，当多个基因同时引入到单一微生物中时，生物合成效率会显著降低，因为这会给底盘细胞带来巨大的代谢压力。这一普遍存在的问题可以通过使用合理设计的微生物群落来克服，微生物群落可以将一条生物合成途径模块化并分离在多个独立的细胞中。因此，每个底盘细胞都可以独立设计，以实现联合通路的最佳功能。
表2总结了有用化合物生产的最新进展。根据微生物群落中微生物种类的不同，对这些成功的尝试进行分析，分为细菌-细菌、真核生物-真核生物和细菌-真核生物三大类，为更多人工微生物群落的构建提供了具体的经验。在细菌-细菌体系中，大肠杆菌是最常用的底盘菌株。Zhang等设计了一种新型大肠杆菌-大肠杆菌共培养体系，用来生产顺，顺-己二烯二酸（MA）和4-羟基苯甲酸（4HB），这两者都是制造增值化合物如己二酸、对苯二甲酸、穆康酸和香草醇的重要中间体。在该研究中，利用第一株大肠杆菌转化葡萄糖为中间体3-脱氢莽草酸（DHS），再由第二株大肠杆菌同化转化为MA或4HB。为了消除这两个菌株之间的碳源竞争，在第一个菌株中去除了磷酸转移酶系统，在第二个菌株中删除了催化D-木糖和D-木酮糖相互转化的木糖异构酶基因xylA。由此产生的微生物群落可以同时消耗木糖和葡萄糖。这一策略成功地克服了中间体分泌水平高、糖液利用效率低的局限性。这一原理还被用于从葡萄糖和甘油混合物中生产生物聚酰胺合成所需原料——尸胺，以及从葡萄糖和木糖混合物中生产糖苷。此外，通过将上游和下游通路调节到两个独立的大肠杆菌菌株中，Zhang等人构建了以甘油为唯一碳源来支持两株菌生长和MA生产的微生物群落系统。大肠杆菌-大肠杆菌共培养可用于单一碳源环境下的复杂生物合成工程，而不考虑这两个菌株之间的生长竞争。通过将设计好的4-乙烯基酚或4-乙烯基儿茶酚生产模块与氰基-3-O-葡萄糖苷生产重组细胞组装在一起，首次报道了利用大肠杆菌共培养合成重要的红酒色素——吡喃花青素。采用该方法提取吡喃花青素比传统的植物提取方法更稳定。此外，合成大肠杆菌群落系统已经被设计用于越来越多有价值化合物的生产，包括像咖啡酰苹果酸这样的酯类化合物，像α-蒎烯这样的萜类化合物，像白藜芦醇这样的多酚化合物，白藜芦醇葡萄糖苷，像3-氨基苯甲酸（3AB）这样的氨基酸衍生物，尸胺，像芹黄素葡萄糖苷这样的黄酮类化合物，像水杨酸2-O-b-D葡萄糖苷这样的糖苷化合物和单醇等。除了大肠杆菌外，还设计开发了氧化葡萄糖杆菌和古龙酸菌的共培养技术，用于一步生产维生素C的前体2-酮基-L-古龙酸（2-KGA）。
表2 模块化共培养工程在有复合生产中的应用
与细菌-细菌群落系统相比，真核-真核生物的尝试报道较少。一个典型的例子是莫纳可林J及其衍生物洛伐他汀（一种非常重要的用作抗高胆固醇血症药物的天然产品）的生物合成模块，可以组装到两株巴斯德毕赤酵母菌株中。微生物群落可从甲醇中产生250.8mg/L的洛伐他汀和593.9 mg/L的莫纳可林J。与单培养相比，洛伐他汀的生物合成能力提高了2.2倍，莫纳可林提高了13.4%。
不仅限于原核生物之间的合作，细菌和真核生物之间的跨物种群落也已经发展起来，用于生物合成复杂的有价值产品。例如，Rodríguez-Bustaante等人分离到一个由酵母菌Trichosporon asahii（阿萨希丝孢酵母）和细菌Paenibacillus amyllyticus（解淀粉类芽孢杆菌）组成的微生物群落，其中T.asahii负责将叶黄素分解成β-紫罗兰酮，而P.amylolyticus 将β-紫罗兰酮还原为7,8-二氢-β-紫罗兰酮和7,8-二氢-β-紫罗兰醇衍生物，它们是烟草香气中存在的化合物。在另一种工程肠杆菌和酿酒酵母的跨物种共培养中，以葡萄糖为唯一碳源的条件下产生了2mg/L的含氧紫杉烷（有效的化疗药物），尽管它们都不能产生紫杉醇前体。在此过程中，工程大肠杆菌负责上游紫杉烯的从头合成，然后通过酿酒酵母将其转化为氧化紫杉烷，其中细胞色素P450模块被有效表达。然而，酿酒酵母产生的乙醇显著抑制了大肠杆菌的生长和紫杉烷的产生。因此，为了更好地控制这两个菌株的种群分配，采用了共生碳源方法，其中木糖被大肠杆菌消耗并转化为乙酸，然后乙酸被酿酒酵母进一步代谢为氧化紫杉烷。经过基因改造后，最终获得了33毫克/升的高水平氧化紫杉烷产量。最近，Zhang等人构建了大肠杆菌和酿酒酵母的交叉培养物以提高柚皮素的生产效率，柚皮素是一种有价值的天然产物，广泛分布于芸香科柑桔属植物中。具体而言，内源酪氨酸途径被引入大肠杆菌中用以高水平的产生酪氨酸，随后被下游工程酿酒酵母转化为柚皮素。结果，从木糖中最终产生21.16mg/L的柚皮素，与酵母菌单一培养相比，滴度增加了8倍。这种系统也被设计用来在工程酵母之间交换酪氨酸和精氨酸。
除了两种微生物的相互作用之外，含有三种或三种以上菌株的多物种培养联合体也被成功地用于构建较长的串联或平行合成途径。例如，已经设计了包含大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和希瓦氏菌的工程混养物用于微生物发电。在此过程中，大肠杆菌首先消化葡萄糖产生乳酸，乳酸被用作碳源和电子供体。随后，乳酸盐被枯草芽孢杆菌转化为核黄素用于电子穿梭。最后，希瓦氏菌作为外生电因子来发电。反过来，希瓦氏菌氧化乳酸盐产生乙酸盐，乙酸盐作为大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的碳源。因此，这三个物种形成了一个互养的微生物群落，它们在一起能够更好地产生能量。在优化的条件下，11mM的葡萄糖可以转化为稳定的约550 mV的电力输出超过15天。模块化的共培养工程的潜能可以解决与复杂和非线性生物合成途径相关的挑战。通过使用混合碳底物来最小化上游碳通量的竞争，构建了由三个大肠杆菌菌株组成的高效微生物群落系统，用于非线性迷迭香酸合成。与单一培养相比，迷迭香酸产量提高了38倍。另一个混合培养的例子是花青素的合成，花青素是一种重要的保健色素。在该研究中，将生产苯丙酸、黄烷酮、黄烷-3-醇和花色苷的15个酶促反应分置于4个独立的大肠杆菌菌株中，首次实现了异源生产黄烷-3-醇。这项研究代表了迄今为止最复杂的合成联合体，为代谢工程在外源宿主中重建广泛的代谢途径提供了新范例。
尽管在利用微生物群落合成有价值化合物方面已经取得了显著的进展，但利用这种多物种培养实现工业化应用仍然是一个巨大的挑战。在未来，除了需要讨论模块化菌种选择和折衷培养条件的优化外，还应考虑更多的实际问题：①如第一部分所讨论的，不同微生物之间的物理接触会导致一些次级化学物质的产生，这给控制微生物种群结构带来了更大的困难，并且应考虑这些诱导产生的次生化学物质是否会影响合成的天然化学物质的质量；②与单细胞工厂相比，微生物群落内的各个物种将通过底物或中间体的交换而相互作用，如何提高细胞间底物或中间体转移的效率是构建高效微生物群落的关键。此外，一些中间代谢物的浓度较低，这会给配对微生物有效地感知和捕获它们带来困难。因此，应该设计一些通用的发酵设备来加强微生物群落系统内的底物或中间体的转移；③微生物群落系统是动态的，很难实现长期的生产稳定性。因此，现在从实验的角度来判断微生物群落的潜力还为时过早。所以应该进行更多的大规模试验，特别是长期的培养过程。由于稳定性、可控性、安全性和成本是评价工业生产过程的关键因素，因此在以后的实验设计中应更多地关注这些方面。
1. Qian, X.J., Chen, L., Sui, Y., Chen,C., Zhang, W.M., Zhou, J., Dong, W.L., Jiang, M., Xin, F.X., Ochsenreither, K.,2020. Biotechnological potential and applications of microbial consortia.Biotechnology Advances 40.
原文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0734975019302009#t0005
中国科学院生态环境研究中心
环境生物技术重点实验室
邓晔 研究员课题组发布
编译：赵博
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