蛋白质中二硫键特征的质谱分析技术及其应用

蛋白质中二硫键特征的质谱分析技术及其应用

摘要
二硫键是蛋白质的重要结构部分：它们能保证正确的折叠、稳定性和正确的功能。随着越来越多的蛋白质用于生物治疗，特别是高二硫键结合的单克隆抗体，确认二硫键的正确连接性和蛋白质治疗中是否存在二硫键变体非常重要。这些研究有助于确保安全性和有效性。因此，二硫键是蛋白质的重要中，二硫键是蛋白质的重要质量属性之一。然而，由于生物分子的复杂性，二硫键分析具有挑战性。质谱（MS）它已成为表征这些复杂生物分子的主要分析工具，并报告了几种方法来满足二硫键在蛋白质中的挑战性任务。在本综述中，我们描述了基于质谱的相关技术，并提供了蛋白质二硫键分析所需的有效考虑因素。总结了合适的样品制备方法、二硫键分析的裂解技术、基于裂解技术的最新二硫键图谱绘制方法，以及从液相色谱-质谱/质谱数据中快速分析二硫键的自动算法。参与蛋白质表征方法开发的研究人员可以利用本文中的信息促进基于蛋白质二硫键分析新方法的开发。此外，生物治疗的个体特征，特别是抗体中二硫键的定位，可以利用本综述选择生物产品二硫键分配的最佳策略。
介绍

二硫键在蛋白质中的形成及其重要性

二硫键是细胞内蛋白质生物合成过程中的两个半胱氨酸（Cys）翻译后修改树脂硫原子之间形成的蛋白质。由共价键形成Cys游离硫基残基（SH）侧链氧化主要由酶催化引起，包括蛋白质二硫键异构酶和内质网氧化还原素1[1，2]。大量蛋白质含有二硫键。根据已知的817个含有4594个二硫键的血浆蛋白三级结构，Butera等人[3]估计蛋白质与二硫键的比例为1:5。因此，Farrah等人[4]鉴定的约2000个血浆蛋白将含有约1万个二硫键，仅血浆蛋白中就有大量二硫键。二硫键在蛋白质折叠过程中起着重要作用，在结构和功能上起着重要作用。
在结构上，二硫键确保蛋白质的正确折叠；它们可以导致结构异构体[5]，稳定蛋白质的天然高级结构，这是实施其生物功能所必需的[6、7]。因此，二硫键工程的概念是生物技术中有吸引力的选择，因为非天然二硫键可以通过工程进入蛋白质来提高蛋白质的稳定性。就目前而言，一些最初缺乏二硫键的蛋白质在工程二硫键的作用下更为稳定[8,9]，而具有天然二硫键的蛋白质的稳定性随着额外二硫键的引入而增加[10–13]。在某些情况下，工程二硫键增加了蛋白质的半衰期[8,14]，减少了自聚[15]和免疫原性[16]。含有工程二硫键的肽除蛋白质外，还表现出稳定性和半衰期[17、18]的增加。虽然这些试验证明了蛋白质和肽中额外二硫键的好处，但并非所有工程二硫键都能提高蛋白质的稳定性[19]。
一些二硫键，称为变构二硫键，负责蛋白质的有效生物功能，会导致蛋白质活性的变化[20]。Butera等人[3]和Hogg[21]广泛总结了变构二硫键在血液和癌细胞中的作用。最近的报告显示，利妥昔单抗和曲妥珠单抗(以IgG1.一些二硫键的还原和烷基化增加了修饰药物和一些Fcγ同类受体的组合亲和力[22,23]，但也导致与其他类型的组合亲和力Fcγ[23]减少了受体的结合力。在某些情况下，参与二硫键Cys残基突变可能不会影响蛋白质的生物活性，如抗性CD44 IgG抗体的情况，Cys对丝氨酸的突变导致结构改变，但对蛋白质与受体和补体C1.组合不影响[24]。然而，并非所有IgG抗体都是这样。
因此，蛋白质中二硫键连接模式的定位为蛋白质稳定性、结构功能关系和任何二硫键介导的蛋白质亚型的研究提供了重要信息。此外，二硫键的表征在生物制药的发展过程中具有重要的意义，以确保生物制剂的安全性和有效性，近年来生物制剂在医药市场上的应用急剧增加。因此，对蛋白质的有效分析方法的需求日益增加，特别是在蛋白质中二硫键的准确表征。

二硫键在生物治疗中

由于越来越多的重组蛋白被用作治疗癌症、关节炎、哮喘、糖尿病等疾病的生物治疗(生物制剂)[25、26]和各种疾病的疫苗[27、28]，蛋白质二硫键的特性在生物制药行业中变得越来越重要。这些生物制剂来自激素[25、29]、单克隆抗体[25、26、30]和生长因子[31、32]等大量蛋白质。所有这些生物分子都含有二硫键合蛋白。在这些蛋白质中，高二硫键结合IgG抗体（IgG1和IgG有16个二硫键，IgG二硫键有18个，IgG3有25个二硫键)[33]和IgG市场上最流行的基本疗法。因此，二硫键是抗体药物的许多关键质量属性之一，必须在其整个开发阶段进行监测，因为生物治疗药物的制造[34、35]和储存[36、37]可能会出现二硫键的减少和混乱。图1显示了四类IgG二硫键模式。据报道，游离二硫键（还原二硫键）可导致非天然二硫键和聚集体形成[38、39]，并可能导致生物治疗免疫原性和生物活性丧失。因此，在生物发育过程中，有必要表示二硫键，以确认二硫键的正确连接，并验证是否有二硫键变体，以确保药物的安全性和有效性。此外，监管机构还需要全面描述生物分子中的二硫键模式，以满足生物制剂的质量设计要求[40、41]，因此需要有效的方法来绘制生物治疗中的二硫键。

二硫键特性分析方法

采用多种分析技术，包括核磁共振波谱[42–44]、X射线晶体学[45]，埃德曼降解[5，46]，对角纸电泳[47，48]和液相色谱（LC）与质谱联用（MS）[49–这是本文的重点。核磁共振波谱和X射线晶体学在分子水平上提供了关于二硫键的信息，但它们需要大量的高纯度样品，通常不用于二硫键绘制，因为这些方法解决了结构的低吞吐量。传统的方法，如Edman尽管降解法和对角线纸电泳法是20世纪60年代初二硫键定位的主要方法Edman降解法(结合MS）[5，46]在本世纪末仍然很少使用。随着质谱技术的出现，液相色谱-质谱法和液相色谱-串联质谱法已成为蛋白质二硫键定位的常用方法。
自底向上质谱是蛋白质二硫键分析中应用最广泛的方法。自下而上方法的吸引力包括各种酶的可用性，将大生物分子消化成更容易分析的小块（含有完整的二硫键肽）、几种软电离技术、互补裂解技术、质谱分析前酶分离的液相色谱系统。使用MS二硫键分析的关键挑战包括：高Cys含量与复杂二硫键连接的蛋白质，防止样品制备过程中二硫键干扰，测量低水平的非天然二硫键定量二硫键介导的蛋白质异构体，选择合适的方法(或裂解技术)分配蛋白质中的二硫键，尤其是含有复杂二硫键模式的蛋白质。为了应对这些挑战，开发了许多二硫键分析方法。

图1显示四类IgG典型的抗体二硫键（DSB）模式结构。黑色和红色分别表示常量（C）和变量（V）区域。H代表重链，L代表轻链。VL和CL是轻链上的结构域，VH、CH1、铰链、CH2和CH三是重链上的结构域。IgG3.铰链区有15个残基片段重复三次；每个片段包括三个DSB

在下一章中，我们回顾了最近用于二硫键分析的自底向上质谱，并为步骤提供了重要的考虑。许多关于二硫键分析的评论，包括2007年之前开发的附加方法，已发表[49–51]。在这里，我们首先深入研究样品制备，这是成功绘制蛋白质中天然和替代二硫键的关键步骤。为防止样品制备过程中引入二硫键伪影(或干扰)，我们提供了几个重要的提示。最后，我们讨论了二硫键连接肽在各种质谱解离技术连接肽的裂解特性，这对二硫键的定位非常重要，并描述了近十年发展起来的基于质谱的二硫键表征方法。

样品制备用于自底向上质谱二硫键分析

总结样品制备方法

样品制备是自底向上质谱分析二硫键的关键步骤。一般来说，分析通常以两种方式进行：非还原（完整）分析或还原/完整分析。非还原法是最常用的方法，样品制备工作流程如图2所示。这种方法需要任何自由Cys烷基化和去糖基化(只有必要时才能使用糖蛋白；参见样品制备)-
糖蛋白定量(更多细节)-
在不减少二硫键的情况下修饰蛋白质，研究二硫键连接白质中的二硫键连接[52–54]。对于完整/还原法，制备两批酶消化样品：一批二硫键完整（与前一种方法相同），另一批二硫键恢复。蛋白质的二硫键连接是通过比较两个样品批次的肽图谱（LC[55，56]确定图谱。本文详细讨论了基于这些样品制备方法的二硫键分析方法-
二硫键分析法^

样品制备过程中二硫键伪影的预防

样品制备过程中的一个主要要求是防止形成非天然二硫键(二硫键伪影)。为此，最近报道了一些有效定位蛋白质中二硫键的方法，而不是在样品制备过程中形成二硫键伪影[57、58]。在样品制备过程中，二硫键伪影可以通过三种主要方式引入:(1)两个游离半胱氨酸残基的反应，(2)游离半胱氨酸残基与二硫键的反应，以及(3)之前参与二硫键的两个半胱氨酸残基的反应[59–62]；这些可能的二硫键形成方法如图3所示。这些反应是碱性的pH值[63，64]和高温[63，65，66]下非常有利，在高温下通常会发生二硫键争夺，尤其是对于含有游离巯基的蛋白质。除pH除了值和温度，硫醇、二硫键和硫醇的空间效应(暴露)也会影响二硫键的形成，如Kerr如[64]所示，但这些因素在样品制备过程中无法控制。

图2二硫键（DSB）分析流程。（A） DSB非还原蛋白消化液样品分析制备。
游离Cys烷基化对防止二硫化物洗牌非常重要（见B消化）。对于糖蛋白，去糖基化可以确保数据不那么复杂（见糖蛋白样品制备）。（B） 液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）数据的DSB分配

图3样品制备过程中形成非天然二硫键的不同可能途径。Cys残基以天然二硫化物构象显示；标有星号Cys残基被修饰成非自然构象(红色)Cys残基）。（A） 两个游离半胱氨酸残基之间的反应。（B） 游离半胱氨酸残基与二硫键半胱氨酸残基的反应。（C） 以前参加过二硫键Cys残基之间的反应

温度、pH值和游离Cys样品制备过程中必须控制的关键因素是防止形成非天然二硫键。一般来说，用于二硫键分析的样品在室温下制备，然后在37℃下进行酶消化，这种低温不会引发任何Cys反应或二硫键洗牌[63]。然而，即使在室温下，pH该值还会影响二硫键或半胱氨酸的反应性，因此在样品制备过程中必须小心控制[63、64]。样品制备应为弱酸性pH因为它是碱性的pH游离硫醇脱质子产生的硫酸根阴离子氧化与相邻的二硫键（硫醇-二硫键交换）反应形成新的非天然二硫键。与未暴露的巯基相比，更易暴露于溶剂的巯基将更具活性[64]。
因此，在二硫化物分析的样品制备过程中的第一步是盖住任何游离的Cys残基，以防止非天然二硫键的形成。这一步对于所有Cys残基都处于二硫键状态的蛋白质来说也是很重要的，因为游离Cys残基的含量很低。例如，尽管预期四类IgG中的所有Cys残基都是二硫键合的，但在所有四类IgG中都检测到低水平的游离Cys残基[33]，并且如果游离Cys残基未烷基化或未适当烷基化，则它们可能诱发二硫键伪影。常用的Cys烷基化试剂包括碘乙酸（IAM）、碘乙酸（IAA）和N-乙基马来酰亚胺（NEM）[67，68]。Rogers等人[68]表明，NEM是一种比IAM和IAA更适合蛋白质硫醇的烷基化剂，因为它反应更快，每摩尔游离Cys所需的试剂更少，在酸性pH（pH 4.3–7.0）下非常有效，而其他试剂在碱性pH（pH 8.0）下最有效，其中硫醇-二硫键交换和游离Cys氧化反应可与烷基化反应竞争并导致低水平的非天然二硫键。最近，Lu等人[69]报告，当游离硫醇与IAM和IAA在pH 6.5下烷基化后进行RNase A的二硫键定位时，二硫键伪影水平较低，但在相同pH下使用NEM时，未发现伪影，表明IAM和IAA在微酸性pH下不能正确烷基化游离硫醇。

消化

蛋白质可以被化学或酶消化[70]。酶消化是最广泛使用的蛋白质消化方法，有多种酶可供选择，如Switzer等人[70]所述。图4显示了蛋白质消化产生的不同类型的二硫键连接肽。选择合适的酶进行有效的消化是很重要的，因为酶的使用将决定蛋白质消化中二硫键结合肽的类型（图4）。在选择一种酶时，目标通常是选择一种能产生更简单的链间二硫键连接肽的酶，最好只有一个链间二硫键和适当长度的键合链（4-15个氨基酸残基）。这种简单的二肽可以很容易地手动和手动映射
使用现有的分析软件（软件在自动二硫键分配软件中讨论）。产生最简单二硫化物的最佳酶
可以通过使用不同的酶对蛋白质进行硅内消化来发现。选择合适的酶有两个重要的问题：（1）二硫键肽的大小（二硫键肽链的数目和每条肽链的长度）是多少？二硫键连接肽的二硫键连接性有多复杂？也就是说，是否只有链间二硫键、链间和链内二硫键、嵌套链内二硫键等。？如果一种酶不能产生具有简单链间二硫键的二硫键结合肽，可以使用多种酶的组合[71，72]。然而，值得注意的是，使用多种酶可能会导致非常短的二硫键肽，这可能不会保留在反相柱，从而使二硫键分配困难。在这种情况下，有计划的消化可能是必要的，这种消化故意确保错过切割，以便获得更长的肽链[72]。除了产生的二硫键合肽的类型外，另一个重要的考虑因素是所用酶的消化效率。Glatter等人[73]研究了几种蛋白质消化策略，并表明胰蛋白酶和Lys-C的结合比单独使用胰蛋白酶具有更好的消化效率。此外，对具有完整二硫键的蛋白质的消化可能导致低消化效率，因为当二硫键完整时，蛋白质的某些部分可能不会很好地暴露于酶（非还原蛋白质）。

图4各种蛋白质中不同类型的二硫键合肽（DSBPs）的实例。绿色天冬氨酸（D）代表以前的天冬酰胺残基，这些残基在肽N-糖苷酶F（PNGase F）去糖基化后转化为天冬氨酸。DSB二硫键，gp140糖蛋白140，rhASA重组人芳基硫酸酯酶A

如前所述，在二硫化物分析的样品制备过程中，最重要的考虑是防止非天然二硫键的形成。因此，与烷基化反应一样，在消化过程中，pH值和温度也是至关重要的。蛋白水解消化通常在37°C下进行，此时不会发生混乱。Wang等人[58]最近研究表明，胰蛋白酶加Lys-C消化在室温下也能高效进行。此外，pH值也是防止蛋白质消化过程中二硫键洗牌的关键因素。由于在碱性pH条件下制备样品时会引入二硫键伪影[59，60]，因此中性或微酸性pH是首选的蛋白质消化二硫键图谱。最近，Sung等人[57]研究了溶菌酶和贝伐单抗（一种IgG1抗体药物）中的二硫键在pH值为6和7时与胰蛋白酶、胰蛋白酶加Glu-C和Lys-C以及pH值为5到7时与溶菌酶和贝伐单抗（一种IgG1抗体药物）的相互作用。用胰蛋白酶、胰蛋白酶加Glu-C和Lys-C在ph6消化蛋白时，未观察到二硫键的干扰。然而，当用相同的酶在pH7进行消化时，以及用溶血素在pH5–7进行消化时，观察到二硫键干扰[57]。同样，当胰蛋白酶或赖氨酸-C和胰蛋白酶在pH6.8用于蛋白质消化时，也报道了低水平的二硫键干扰[58，71，74]。尽管如此，在中性或微酸性pH下的二硫键干扰可能取决于除pH之外的各种条件，因为在pH 5.5、6.5和7的缓冲液中胰蛋白酶消化后进行牛胎球蛋白的二硫键标测时未观察到干扰[75]。在某些情况下，在弱酸性pH下，二硫键的混乱可能是由于消化前任何游离半胱氨酸残基缺乏有效的烷基化。确定特定消化条件是否会引入伪影的一个有用策略是，在分析未知蛋白质之前，使用已知二硫键的标准蛋白质检查样品制备方法；该策略已在前面得到证明[75]。值得注意的是，胰蛋白酶和Lys-C在微酸性pH下的消化可能会由于不完全消化而导致错过切割，因为酶的最佳效率分别为pH 8.0和pH 8.0至8.8[70]；因此，单一的消化条件不一定对每种蛋白质都是最佳的。
为了完全消除二硫化物急停的可能性，可以用胃蛋白酶消化蛋白质，胃蛋白酶在高酸性pH（pH<2）[71，74，76]下有效地消化蛋白质，其中不可能通过游离Cys再活性形成非天然二硫化物。然而，胃蛋白酶的特异性不如胰蛋白酶或赖氨酸-C，它可能产生非常小的二硫键肽，很难分离和分析。尽管如此，单独使用胃蛋白酶和胰蛋白酶（pH
6） 在二硫键模式模糊不清的情况下，消化有助于二硫键的明确分配[76]。

糖蛋白样品制备

糖蛋白的二硫键分析可能需要在质谱分析之前进行去糖基化。为了确定糖蛋白是否需要去糖基化，必须首先确定蛋白质的糖基化位点，并且在样品制备之前，可以使用选择的酶（或酶的组合）进行硅消化，以确定含有二硫键的肽的Cys是否含有被占领的蛋白质糖基化位点。对于某些糖蛋白（例如，单克隆抗体），不需要去糖基化，因为使用常用酶消化产生的二硫键结合肽通常不包含糖基化位点[65]。然而，其他糖蛋白可能包含一个或多个被占领的糖基化位点附近的半胱氨酸残基参与二硫键。在这种情况下，必须在样品制备中加入去糖基化步骤，以降低二硫键合肽的MS/MS数据的复杂性，因为不能简单地将糖基化视为对肽链的修饰[71、75、77]。例如，对含有25个N-键糖基化位点和10个二硫键的HIV-1 Env序列变体C97ZA012 gp140进行胰蛋白酶消化，得到7个胰蛋白酶二硫键肽，这些肽在二硫键链中至少含有一个被占领的糖基化位点[75]。其中一个胰蛋白酶消化物是一个四链二硫键连接肽，有六个糖基化位点。对于这种复杂的情况，去糖基化是必要的第一步。
去糖基化通常在中性或微酸性pH下用肽N-糖苷酶F酶促完成[71，75，78]，如果蛋白质严重糖基化，反应可能需要几天时间[75，78]。因此，必须实现适当的Cys烷基化，以防止在如此长的潜伏期内二硫化物洗牌。此外，去糖基化将被占据的天冬酰胺残基转化为天冬氨酸残基，导致在计算去糖基化二硫键连接肽的分子质量时必须考虑0.985-Da的质量变化。

蛋白质的液相色谱-质谱二硫键分析

蛋白质消化物的分离

在质谱分析之前，通过LC-MS绘制二硫键图需要分离和电离蛋白质消化物。最广泛使用的分离技术是通过填充C8或C18固定相和由极性（如水）和非极性（如乙腈）溶剂组成的流动相（含改性剂，如甲酸和三氟乙酸（0.01–0.1%，v/v））的柱的反相LC。不同类型的柱可用于肽分离，包括微孔（例如，1.0-和2.1-mm内径）[54,79]、毛细管（例如，0.5-mm内径）[80]和纳米（通常为0.075-mm内径）[65]柱。典型粒径在3到5μm之间。填充1.7μm颗粒的色谱柱更常见，但它们需要更高的分离压力，因为压力与粒径的平方成反比。
肽分离通常随后进行在线电喷雾电离和串联质谱分析。然而，在某些情况下，待分析的二硫键连肽非常大且丰度较低，在串联质谱分析之前，可以使用离线液相色谱分馏来收集和浓缩含有二硫键连肽的部分（必要时进行进一步消化）[5]。

二硫键分析的碎裂技术

碰撞诱导离解（CID）和电子转移离解（ETD）是基于质谱的二硫键分析中最常用的碎裂技术，前者是中性试剂气体与分析物离子碰撞，后者是电子载体与相关离子反应。图5显示了来自IgG3单克隆抗体的简单链间二硫键合肽的CID和ETD光谱，其显示了由于二硫键合肽受到CID（图5a）和ETD（图5b）裂解而产生的特征片段离子峰。
CID通常会导致肽-背-骨（酰胺）键断裂，同时保持二硫键完整，从而产生含有二硫键的b和y离子（图5a中红色的离子）以及不含有二硫键的离子（图5a中绿色的离子）。尽管先前对二硫键结合肽的CID生成产物离子的分配是基于在CID期间只有一个肽键被裂解的假设，但Clark等人[80]最近表明，在二硫键结合肽的CID裂解期间，两个肽键的裂解（双重裂解）是常见的。图5a中红色括号中的离子是这种解理的例子。尽管CID通常不裂解二硫键，但已有一些实例报道，在CID光谱中，由于裂解C–S和S–S（二硫键）键而产生的硫醛、过硫化物和脱氢丙氨酸离子峰存在[72，82]。
与二硫键结合肽的CID产生的产物离子不同，二硫键的裂解是ETD裂解的主要反应途径。通过产生c和z离子，主链（酰胺）断裂也会发生，尽管这种断裂途径通常发生的程度较小[83，84]。因此，与二硫键连接的肽相对应的片段峰（例如，图5b中m/z 250.4和1179.3处的峰）在ETD光谱中通常比c/z离子峰更强烈[53、54、83]。键合肽骨架断裂产生的离子可能包含也可能不包含完整的二硫键（图5b中红色和绿色的片段离子）。
除CID和ETD外，高能碰撞离解（HCD）[85]和称为电子转移和高能碰撞离解（EThcD）[86，87]的双重碎裂技术是一些Orbitrap质谱仪中可用的较新碎裂技术，它们在二硫键分析方面正在取得进展[69，74，79]。HCD具有类似于束型CID的碎裂模式[88]，并且它只产生b/y离子，而EThcD光谱抑制了ETD和CID光谱中存在的产物离子，并且在比较研究中其表现优于ETD[74]。此外，紫外光解是另一种用于二硫键分析的碎裂技术[89，90]。如在ETD条件下所观察到的，通过紫外线光解二硫键连接的肽的碎裂导致二硫键的选择性断裂[90]。

图5 IgG3单克隆抗体CH2结构域二硫键合肽的碰撞诱导解离（CID；a）和电子转移解离（ETD；b）光谱。光谱显示了由二硫键（DSB）连接的肽的主链断裂产生的b/y（a）和c/z（b）离子的特征。不包含DSB的碎片离子用绿色标记，包含完整DSB的碎片离子用红色标记。两次裂解事件产生的含有完整DSB的CID片段离子在括号中。在ETD光谱（b）中，在m/z250.4和1179.3处观察到由DSB连接的含Cys的肽的强烈峰。这些峰是由于ETD对DSB的裂解而产生的，在一个实验中没有观察到

选择用于二硫键分析的裂解技术的考虑因素

选择合适的碎片技术或数据采集技术的组合对于促进MS/MS数据中二硫键的分配至关重要。碎裂方法的选择通常基于二硫键的复杂性、二硫键结合肽的大小，以及结合链的氨基酸序列。尽管CID或ETD可用于分配简单链间二硫键结合肽中的二硫键（如图5所示），但对于涉及链内或链间和链内二硫键的复杂二硫键的分配，仔细选择裂解方法是必要的，具有多个肽链的大的二硫键合肽和非常小的二硫键合肽。
正如Cole等人最近证明的那样，ETD优先用于通过二硫键完全环化的肽的裂解。这种肽的CID裂解通常不会显示任何骨架序列离子，而ETD会导致二硫键和肽骨架的裂解，从而显示可用于分配二硫键的离子[91]。如Wu等人[52]所述，ETD随后进行CID-MS3步骤，以及如Durand等人[92]所述，涉及羟基自由基加成然后进行CID裂解的裂解技术也可用于绘制此类二硫化物。
对于复杂的二硫键情况，例如嵌套的二硫键和Cys结，ETD和CID都不足以作为一种独立的技术来明确地分配复杂的二硫键连接性。在这种情况下，结合ETD和CID片段的方法将是破译二硫键连接性的理想方法[71,93]。EThcD片段化方法在这些复合物二硫化物的定位上是很有前途的，但目前还没有应用于此类情况。就大小而言，ETD更适合于含有三个或更多通过链间二硫键连接的肽的大的二硫键结合肽的分配。由于ETD需要高电荷离子才能有效地裂解，因此这种大的肽很容易在足够高的电荷状态下电离以进行ETD分析。由于二硫键的优先断裂，大的多链二硫键结合肽的ETD光谱不太复杂，它们清楚地揭示了哪些肽是直接相互连接的[75]。然而，这种大的二硫键连接的肽的CID光谱是复杂的并且难以分配（例如，由于几个双分裂），并且光谱不能揭示哪些肽链彼此直接结合。例如，Go等人[75]使用CID和ETD光谱分配了一个三链二硫键连接的肽，但只有ETD用于明确分配一个四链二硫键连接的肽。三链和四链二硫键合肽的ETD光谱清楚地表明了相互连接的二硫键链[75]。
相比之下，CID是分析含有几个相邻脯氨酸残基的肽链的小的二硫键肽和二硫键肽的理想方法。在这种情况下，最好使用CID，因为小的二硫键结合的肽在高电荷状态下可能不会电离，这是ETD分析所需的，并且含有相邻前体残基的肽链在经受CID裂解时会有效地裂解，而不是ETD裂解，因为脯氨酸的N–Cα环结构[94]。例如，IgG3的铰链区含有一个小的二肽，与CPEPK连接的CPEPK和与SCDTPPPCPR连接的SCDTPPPCPR二硫化物，最近对IgG3二硫键的分析表明，由于尺寸较小（第一个二硫键连接的肽）和肽链上的几个相邻脯氨酸残基（两个二硫键连接的肽），这些肽链在ETD条件下没有很好地断裂，但使用CID数据对它们进行了明确的分配[54]。因此，除了二硫键连接的肽的大小外，含半胱氨酸的肽的氨基酸序列也可能是选择用于二硫键分析的有效裂解技术的一个因素。
鉴于这些解释，研究人员必须对蛋白质进行电子消化，以便研究二硫键连接肽的可能类型（见图4），并确定哪种裂解方法（或方法组合）适合于明确绘制感兴趣蛋白质中的二硫键。一般来说，ETD和CID数据的收集证明是非常有用的，因为数据集是如此互补[53，54]。

二硫键分析的自底向上方法

近年来，基于上述碎裂技术的各种自底向上质谱方法被报道。图6显示了用于二硫键分析的自下而上方法的示意图。这些方法通常分为两大类：（1）还原和非还原蛋白质消化（轮廓比较）和（2）仅完整（非还原）蛋白质消化的二硫键图。第二类可进一步分为需要化学或电化学柱后还原二硫键或气相二硫键还原的方法（ETD和EThcD碎片）和不需要任何还原的方法（通常为CID和HCD方法）。在下面的部分中，我们将回顾过去十年中开发的自底向上方法。

剖面比较：简化和非简化分析

通过剖面比较绘制二硫键图通常用两个样品：没有还原二硫键的蛋白质消化物（未还原样品）和还原二硫键的消化物（还原样品）。两个样品在两次LC运行（实验）中分离，未还原样品的紫外或总离子色谱图中存在但还原样品中不存在的肽通常被认为是二硫键合的，MS/MS数据可用于分配二硫键[55、56、77]。
我们提出三个最近的例子，其中完全或部分还原的二硫键是用来协助二硫键映射。基因泰克的研究人员使用还原和非还原肽作图技术来分配一种不寻常的IgG1抗体变体的二硫键，这种抗体变体是通过大小排阻色谱法鉴定出来的[95]。大量实验结果表明，该单克隆抗体变体含有一个额外的轻链，通过二硫键与IgG1单体相连。LC–MS/MS分析变体的未还原和还原消化物，以确认额外轻链与IgG1单体的二硫键位点。在第二个相关示例中，Klapoetke和Xie[96]提出了一种从标准剖面比较法中分离出来的方法。为了减轻制备和分析两个单独样品的需要，他们在酶消化之前对二硫键进行了部分还原，并将生成的游离Cys烷基化。混合样品的LC-MS/MS数据，包含部分还原和非还原的二硫键连接肽，用于分配蛋白质的二硫键。该方法适用于分配复杂的二硫键，如Cys结，而简单的二硫键可以通过非还原样品进行映射[96]。Albert等人也使用了部分还原法来正确分配富二硫肽中的二硫键。将多肽固定在固定相上，一次只能还原一个二硫键，并采用不同烷基化试剂的顺序烷基化步骤来阐明二硫键的连接性。这些方法的挑战在于优化还原剂以获得部分还原，以及优化烷基化剂以使还原物种完全烷基化。在工作流程中需要二硫化物还原的技术的一个缺点是需要制备和分析两个样品或制定可提供部分还原的样品制备条件，从而增加样品制备和分析时间。

图6二硫键（DSB）分析的自下而上方法。这些方法通常分为两大类：（1）用还原的和未还原的DSB对蛋白质消化液进行DSB定位（剖面比较）和（2）仅用完整的（未还原的）蛋白质消化液进行DSB定位。非还原分析可进一步分为涉及DSB柱后还原或气相中DSB还原的方法[电子转移解离（ETD）和电子转移及高能碰撞解离（EThcD）碎裂方法]和不需要DSB还原的方法[碰撞诱导法]解离（CID）和高能碰撞解离（HCD）碎裂方法）。柱后还原后的数据分析尚未自动匹配。液相色谱、质谱、串联质谱

完整（非还原）分析

绘制二硫键的另一种方法是绘制非还原蛋白质消化物（完整消化物）的肽图，而不需要还原的小份。从非还原蛋白质消化物中分配二硫键的方法可分为三类：涉及柱后化学或电解还原二硫键的方法、涉及气相还原二硫键的方法和不涉及裂解二硫键的方法。在本节中，我们将描述前两类中的方法。对于最后一类，二硫键通常通过使用CID数据的肽映射来分配，通过计算预期二硫键肽的理论m/z值（在不同电荷状态下）并搜索MS数据中的计算值；离子通过鉴定MS/MS光谱中的特征碎片离子来分配[78，80]。已经开发了几种自动工具来识别二硫键结合的肽，而不需要切割二硫键；这些工具在用于自动二硫键分配的软件中进行了讨论。
柱后还原法

已经开发了几种方法，其中未还原的蛋白质消化物通过液相色谱分离，然后在质谱表征之前，通过柱后部分还原二硫键合肽，通常是通过酸裂解。二硫键的柱后还原可通过化学方法引入还原剂，如三（2-羧乙基）膦（TCEP），通过电离过程中的源内还原，或通过电化学方法，通过放置在柱流动路径中的电化学电池上的电位增加来实现。
柱后化学还原二硫化物键合的前水解消化物通常涉及通过反相LC分离未还原的蛋白质消化物，并且将来自柱的洗脱液与优化量的还原剂（例如TCEP）混合（通过混合三通）以部分还原二硫键，正如Li等人[98，99]所证明的那样。由于液相色谱分离后仅发生部分二硫键还原，因此具有完整二硫键的二硫键连接肽及其相应的含半胱氨酸的肽（由二硫键还原产生）将具有相同的保留时间，并且将在相同的全扫描质谱中检测两者。为了鉴定二硫键合肽，比较了所有含半胱氨酸肽的提取离子色谱图，并将保留时间相同的含半胱氨酸肽指定为二硫键合肽[98，99]。存在具有相同保留时间的二硫键连接的肽，其分子质量相当于两个含半胱氨酸的肽的分子质量之和减去2 Da，从而证实了这种分配。扰乱的二硫键很容易以同样的方式分配[99]。Liu等人[100]使用这种方法来绘制IgG2抗体的二硫键，但不是仅使用LC–MS数据，而是使用LC–MS/MS（CID）数据来明确描述二硫键结合肽的LC峰及其相应的含Cys肽的LC峰。
除化学还原外，电喷雾电离过程中的源内还原也可用于二硫键连接肽的部分还原，如Cramer等人[79]所示。柱后源还原，然后对部分还原肽进行HCD分析，用于开发一种方法，能够分配蛋白质中复杂的链内和链间二硫键，包括涉及紧密间隔的Cys残基的二硫键[79]。
二硫键表征方法包括柱后电化学还原质谱分析前的二硫键。Cramer等人[101]最近证明，小蛋白质（如人胰岛素）中的二硫键分配可以通过将完整蛋白质直接注入电化学细胞来完成，以部分还原完整蛋白质中的二硫键，然后用MS/MS（CID片段化）确定蛋白质的序列覆盖率。对于较大的蛋白质（如人血清白蛋白和核糖核酸酶B），在柱后电化学还原二硫键合肽和串联质谱裂解之前，蛋白质水解消化和蛋白质消化液的液相色谱分离是必要的，最近Switzar等人[102]证明了这一点。Zheng等人[103]和Zhang等人[104]报道了一种利用柱上蛋白质水解消化和电化学还原的快速方法。在这种方法中，在线胃蛋白酶柱用于快速消化完整蛋白质，二硫键合肽通过使用不同的电化学电位部分或完全还原，然后进行解吸电喷雾电离MS/MS[103]。这种在线消化方法提供了前所未有的消化和还原速度（小于10分钟），并且由于样品处理和胃蛋白酶在低pH下消化较少，导致二硫化物伪影的可能性非常低。
一般来说，尽管化学和电化学柱后部分还原方法确实节省了样品制备时间（与还原和未还原样品相比），但优化还原条件以获得还原和未还原肽的足够信号是一个主要挑战。

气相解离（还原）法

由于ETD主要裂解二硫键（气相还原），导致含有大量Cys的肽产物离子，因此开发了几种二硫键表征方法，利用独特的ETD裂解模式来分析非还原蛋白质消化物以进行二硫键定位。Jiang等人[105]报告了一种方法，该方法结合了二硫键结合肽的交替ETD/CID片段化（MS2）和因ETD-MS2解离二硫键而产生的含半胱氨酸片段离子的CID-MS3片段化。该方法适用于映射含有复杂二硫键的二硫键肽，如嵌套二硫键和Cys结[71]，以及被二硫键完全环化的肽[91]。然而，由于额外的CID步骤产生了大量的数据，对于不含复杂二硫化物的样品，该方法可能不是必需的。最近，Massonnet等人[93]报道了一种模拟技术，用于含有两个二硫键的肽的二硫键分配。通过ETD打开二硫键后，生成的物种通过离子迁移率分离，然后通过CID裂解对分离的离子进行表征[93]。
Clark等人[53]报道了一种更简单的基于ETD的方法，该方法适用于含有简单链间二硫键结合肽的样品，包括具有多个（三到四个）二硫键连接链的二硫键。该方法不需要MS3步骤，并且不是搜索所有预期（已知）二硫化物和可能的无序二硫化物的m/z值，而是生成所有含半胱氨酸肽的提取离子色谱图，对提取的离子色谱图中的峰的ETD光谱进行了询问，以确定含有半胱氨酸的肽的键合伙伴[53，54]。当含有半胱氨酸的肽的片段离子在相同的ETD光谱中被鉴定，并且它们的质量之和减去2 Da（2H的质量）与预期的二硫化物的质量匹配时，二硫化物被指定。键合肽主链断裂产生的c和z离子可用于进一步确认键合链的同一性[54]。这种提取离子色谱法适用于绘制二硫键连接性未知的蛋白质中的二硫键，也适用于快速验证非天然或交替的二硫键。图7显示了提取的离子色谱图，用于在IgG抗体中分配正确的和混乱的二硫键。此外，提取的含半胱氨酸肽的离子色谱图也可以提供蛋白质中任何游离半胱氨酸的信息，而无需进行差异烷基化[106，107]。
与ETD裂解类似，简单链间二硫键结合肽的紫外线光解可用于绘制蛋白质中的二硫键，Agarwal等人[90]证明了这一点。在用LC分离未还原的蛋白质消化物后，在离子阱质谱分析仪中用266nm的激光脉冲照射二硫键连肽（包括三链二硫键连肽），导致二硫键的选择性裂解，从而揭示二硫键连肽。然而，这种方法通常无法观察到含半胱氨酸肽的主链断裂[90]。

图7用于识别IgG抗体中二硫键的提取离子色谱图的示例。正确的二硫键以蓝色突出显示。潜在的异常连接用星号标记。（经英国皇家化学学会许可，转载自[54]）

二硫键自动分配软件

人工分析蛋白质中的二硫键是一项具有挑战性和耗时的任务，需要该领域的专业知识。因此，越来越多的自动化工具已经被开发用于利用MS/MS数据快速和高通量的蛋白质二硫键分配。当需要对大量样品进行常规分析时，就迫切需要自动化工具，生物制药行业就是这样。大多数已开发的工具都基于非还原分析工作流程，尽管少数工具也可以通过比较还原和非还原样品的数据来绘制二硫键。
MassMatrix大约在十年前开发，是自动分配非还原蛋白质消化物中二硫键连接肽的重要工具之一[108]。分配仅基于结合肽的主链裂解的片段离子。这是该工具的一个缺点，因为二硫化物键的分配只考虑了有限数量的离子。最重要的是，含有二硫键的碎片离子不考虑用于二硫键映射。一些工具已经被开发出来解决这个问题。DBond[72，82]和MS2DB+[109，110]可以利用二硫键结合肽的几个特征裂解峰，包括含有完整二硫键的b/y或c/z离子，从MS/MS数据映射二硫键。鉴于DBond仅从CID数据中分配二肽，并且包括由C–S和S–S键的偶然CID裂解产生的离子（产生硫醛、过硫化物和脱氢丙氨酸离子）[72，82]，MS2DB+可以从CID或ETD数据中分配二硫化物，并且考虑用于CID数据的片段离子包括由以下离子产生的离子：b/y离子引起的水或氨的损失。对于这两个软件产品，在MS数据中搜索所有可能的二硫键肽的理论m/z值，并通过比较二硫键肽的理论和实验MS/MS光谱自动分配其识别的前体离子。此外，这些工具根据匹配片段离子的数量及其强度对指定的二硫键肽进行评分。
Huang等人[111]报道了一种独特的算法，称为通过a1离子识别（RADAR）快速分配二硫键，该算法基于键合链N末端的二甲基标记来分配二硫键合肽，并已应用于单克隆抗体中的二硫键分配[112]。二甲基标记肽在CID光谱中产生强烈的a1离子信号，用于筛选二硫键合肽的光谱。由于这些物种大多含有两个或多个肽链，CID光谱将具有两个或多个a1离子峰，雷达通过首先搜索含有多个a1离子峰的光谱来快速筛选二硫键连肽的光谱[111]。在同一光谱中发现a1离子的含半胱氨酸的肽被认为是二硫键合的，并且通过将前体离子质量与预测的二硫键合肽的分子质量匹配来确认它们，其次是由于二硫键肽链断裂而产生的碎片离子（b/y离子）的分配[112]。雷达分析的实验流程和样品MS/MS数据如图8所示。这种方法适用于快速识别二硫键，包括加扰二硫键，因为不需要二硫键连接性的先验知识。单个肽中的链内二硫化物可以以类似的方式分配，但是可以搜索对应于肽的N-末端的特定（目标）a1离子，而不是在CID光谱中搜索多个a1离子。该软件对于复杂蛋白质混合物（包含20多个二硫键）中的二硫键定位以及快速验证二硫键置乱是有效的[113]。
从HCD和EThcD数据中分配二硫键的工具在过去十年中也得到了发展。2015年，Lu等人[69]引入了软件工具pLink SS，用于使用HCD数据自动分配蛋白质中的二硫键。该软件用于绘制纯化蛋白（IgG）中的简单和复杂二硫键（IgG是含有74个二硫键的10种蛋白质的混合物），并在蛋白质组水平（大肠杆菌150种蛋白质中有199个二硫键）使用HCD数据[69]。软件工具SlinkS通过将ETD和EThcD光谱中的实验MS/MS碎片离子与硅碎片中的离子相匹配来分配链间和链内二硫键[74]。对于ETD数据的分配，软件搜索与二硫键连接肽质量相对应的标记离子，以及带有和不带有二硫键的c/z离子，并且当从EThcD数据分配二硫键时，b/y离子也包括在搜索中。对指定的二硫键连接肽进行评分，并根据用户定义的截止值计算错误发现率。
除了上述工具，一些商业软件产品可用于使用MS/MS数据自动分析蛋白质二硫键连接性，特别是在蛋白质药物中。其中包括BioConfigrm（安捷伦科技）、Byologic（蛋白质计量）、DisulfideDetect（Bruker）、PepFinder、BioPharma Finder和Pinpoint（赛默飞世尔科技）、BioPharmView（SCIEX）和BiopharmaLynx（Waters）。尽管诸如二硫化物检测之类的工具仅需要非还原性蛋白质消化物来进行二硫化物分析，但是PepFinder和BioPharma Finder可以使用非还原性蛋白质消化物或还原性和非还原性蛋白质消化物来绘制二硫键合肽。
虽然二硫键合肽的自动分配有助于蛋白质的二硫键分析，但在这一领域仍有改进的空间。到目前为止开发的大多数工具都可以很容易地分配简单的链间二硫键连接的肽，但是不能很容易地分配含有复杂的相互缠绕的二硫键的二硫键连接的肽，包括链间和链内二硫键，嵌套的二硫键，以及具有一个以上链间二硫键的二肽（二硫盒）。尽管在这些复杂的情况下，有几种方法可以用来手动分配二硫键[114]，但是能够容易地分配这种二硫键结合肽的软件仍然是难以捉摸的。

图8通过a1离子识别（雷达）快速分配二硫键，使用a1离子识别潜在的二硫键，然后通过完整的分子量和b/y离子进行确认。雷达分析的实验工作流程。串联质谱（MS/MS）用于鉴定二硫键合肽。质谱法，分子量，NEM N-乙基马来酰亚胺。（经[112]许可改编）

二硫键分析的挑战

尽管存在高分辨率质谱仪、自动化工具和多种策略来绘制蛋白质中的二硫键，但在二硫键分配过程中仍然会遇到一些挑战。当通过自下而上的二硫键分析确定非天然二硫键时，很难判断它们是样品制备过程中引入的二硫键伪影，还是样品中存在的替代二硫键（二硫键变体）。验证样品制备过程中是否引入二硫化物伪影的一种方法是验证一种使用蛋白质的方法，该蛋白质的二硫键连接性已得到很好的表征[78]。此外，自上而下分析完整的蛋白质需要较少的样品处理，这将是确定非天然二硫键来源的重要第一步[115]。最后，当蛋白质被鉴定含有替代性二硫键（二硫键介导的异构体）时，量化含有天然和替代性二硫键的蛋白质的数量仍然是一个挑战，因为通常二硫键介导的异构体不容易通过标准分离技术分离。最先进的分离方法是解决这一问题的可能途径，尽管二硫键介导的异构体的分离尚未达到基线分辨率[116，117]。

结论

确认特定蛋白质的整体二硫键结构以及验证是否存在任何二硫键介导的异构体[5]或变体[95]非常重要，因为不同的二硫键连接性可能导致不同的蛋白质结构和生物功能。为此，已经开发了几种自下而上的质谱方法。在硅消化是一个重要的第一步，二硫键定位决定什么酶（或酶的组合）使用，以获得简单的二硫键肽，易于分析。在硅消化也可以用来帮助决定什么样的裂解技术将是适合于简单和快速分配光谱的二硫键合肽。大多数二硫键定位方法都是基于CID和ETD裂解技术，但是随着EThcD和HCD等较新的裂解技术的发展，涉及这些技术的加成-二硫键定位方法可能会得到发展。从数据分析的角度来看，需要开发软件工具来自动识别具有复杂二硫键连接性的二硫键肽。最后，二硫化物变体的定量仍然是一个挑战。