Worthington产气荚膜梭菌神经氨酸酶的特征及测定

神经氨酸酶(唾液酸酶)从多种糖蛋白中分离出来N-乙酰神经氨酸(唾液酸)。神经氨酸酶是研究蛋白质化学和细胞生物学中糖蛋白的重要工具（Hatton等，1973）。

艾美捷Worthington神经氨酸酶来源于产气荚膜梭菌。在Cassidy在等人工作的基础上，实验室开发了色谱纯化方法。（1965年）。Wooley和Gommi (1966)它描述了这种神经氨酸酶在测量血清素受体方法中的用途。它还用于确定组织中的组合N-乙酰神经氨酸。

艾美捷Worthington产气荚膜梭菌神经氨酸酶的特点：

最佳pH值：5.0-5.1 (Burton 1963)。在pH 4.0或高于pH 8.0几乎没有活动或活动。

等电点：5.1（Groome和Belyaven 1958）。

与弧菌神经氨酸酶相反，后者需要二价金属。

抑制剂：使用神经氨酸酶抑制剂作为可能的抗病毒和抗菌剂表现出极大的兴趣。（Khorlin等人1970；Haskell等人1970；和Tute 1970）。

稳定剂：血清蛋白，0.3 mg/ml (Cassidy et al . 1965)。

稳定性：纯化制剂4°C至少可以稳定保存两年（Cassidy et al . 1965）。

艾美捷Worthington神经氨酸酶的测定：

Method :该测定基于牛颌下粘蛋白(Worthington Code: MU)唾液酸的释放(NANA)的测量。在特定条件下，在37°C和pH 5.0在这种情况下，一个单位每分钟从牛颌下粘蛋白中释放出来1微摩尔唾液酸。Ziegler和Hutchinson (1972)描述了用于确定神经氨酸酶的偶联酶测定。

试剂：

9 M磷酸中的0.2 M偏高碘酸钠

0.5 M硫酸钠

0.755 M溶于亚砷酸钠0.5 M硫酸钠和0.1 N H2SO4。通过将25 gm亚砷酸钠(分子量129.91）溶解在250 ml 0.5 M并加入硫酸钠5 ml 5 N H2SO4来制备。可能需要稍微加热才能产生溶液。

2.5 N盐酸

2.5 N HCl中的5%磷钨酸

0.6%两次结晶的硫代巴比妥酸0.5 M硫酸钠中。通过将4.5克2x结晶硫代巴比妥酸溶解750 ml 0.5 M制备硫酸钠。加热产生溶液并冷却溶液。结晶沉淀会形成。用上清液检测。

0.1 M乙酸，pH 5.0

1%粘蛋白，pH 5.0。通过将100 mgs Worthington颌下粘蛋白(代码:MU）溶解在9 ml用乙酸制备试剂级水pH值调节至5.0并稀释到最终体积10 ml。溶液在pH 5.0时会显得浑浊。

环己酮。注：阅读产品标签以获得处理说明。

酶：

将酶以1 mg/ml溶解在试剂级水中。使用前立即准备四种稀释液0.1 mg/ml到0.005 mg/ml。

程序：

准备一个37°C水浴。将分光光度计调整到549 nm。进入编号管移液器如下：

粘蛋白0.4毫升

0.1 M乙酸0.5毫升

每隔一段时间，加入0.1 ml相应的酶稀释液。包括0.1 ml水的空白代替酶。在37°C水浴中孵育30分钟。添加到每个试管中1 ml 5%定期停止磷钨酸反应。离心10分钟。取出每一个上清液0.5 ml干洗试管等分试样。加入每一个0.1 ml 0.2 M碘酸钠偏高。静置在室温下20分钟，加入1.0 ml 0.755 M亚砷酸钠。摇动试管直到棕色消失，然后添加3.0 ml 0.6%硫代巴比妥酸。在沸水浴中加热15在冰浴中冷却几分钟5分钟，然后在每管中加入4.6 ml环己酮。环自酮层中的颜色通过涡旋提取。高速离心15分钟。549有色环自酮层与试剂级水空白。

注：样品的最后A 549不应超过0.5吸收单位。